當前位置：首頁 » 資訊中心 » 生命科學

可熒光定量活細胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的試劑 - FAOBlue

來源：作者：人氣：-發表時間：2023-10-10 09:32:00【大中小】

可熒光定量活細胞的脂肪酸β-氧化（FAO）活性的試劑

FAOBlue

FAOBlue是一款可以通過藍色熒光可視化脂肪酸分解的共同途徑——脂肪酸β-氧化（FAO）的活性的試劑。

通過熒光成像，可以簡單地檢測出過去難以檢測的活細胞中的脂肪酸β-氧化活性。

該產品可廣泛應用于對比評估不同細胞種類之間的β-氧化，探索促進或抑制β-氧化活性的化合物，β-氧化相關酶群的基礎研究等領域。

※　本產品基于九州大學研究生院藥學研究院藥物發現化學生物學領域王子田彰夫教授的研究成果，

※　由Funakoshi株式會社商品化并銷售。

※　本產品僅供研究使用。

使用FAOBlue可視化HepG2細胞的FAO活性

添加FAOBlue到HepG2細胞中，觀察活細胞成像，可從細胞中觀察到藍色熒光。另一方面，若使用FAO抑制劑進行前處理，則熒光強度明顯減少，由此可知，藍色熒光的強度取決于FAO的活性。

◆何為脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）

脂肪酸是構成細胞的各種脂質的基本要素，與葡萄糖、氨基酸并稱為能源。尤其是在葡萄糖不足而饑餓的時候，脂肪酸會分解活躍，產生大量的ATP。雖然脂肪酸根據碳鏈的長短以及不飽和度的差別而存在不同的種類，但是由于它的分解屬于線粒體等細胞器的共同分解途徑，因此這種途徑被統稱為脂肪酸β-氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）。

脂肪酸β-氧化主要通過4步酶反應——1）脂肪酸β位的氧化，2）β位的水合，3）β位的氧化，4）裂解，被階段性分解為2個碳原子的短鏈脂肪酸和作為ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2個碳原子的短鏈脂肪酸再通過同一個循環，以2ⁿ個碳原子的短鏈脂肪酸重復分解。

研究提出，癌癥以及非酒精性肝炎（NASH）等疾病中，脂肪酸β-氧化會出現很大的變動，因此開發檢測脂肪酸β-氧化活性的方法備受期待。然而，在活細胞中檢測多種酶參與的脂肪酸β-氧化一直以來都十分困難。

FAOBlue是一款新型脂肪酸β-氧化應答型熒光探針，由九州大學研究生院藥學研究院、專攻藥物發現化學生物學領域的王子田彰夫教授開發。只需將產品添加到培養基中的簡單操作，便可以通過熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。

◆原理

FAOBlue是一種在碳原子數為9的壬酸的碳鏈末端添加了藍色熒光色素香豆素衍生物的化合物，此外，通過用乙酰氧基甲基酯保護末端脂肪酸來提高細胞膜透過性。雖然FAOBlue中含有香豆素衍生物，但是在該狀態下，它不會在405 nm激發下發出熒光。

1. 附著在羧基的乙酰氧甲基具有高疏水性，因此FAOBlue可以跨越細胞膜，有效地攝入到細胞中。

2. 通過細胞內的酯水解酶去除乙酰氧基甲酯，轉換成游離脂肪酸的形態。

3. 通過脂酰CoA合成酶轉換成脂酰CoA，攝入β-氧化途徑。

4. 通過β-氧化循環壬酸（C9）按庚酸（C7）、戊酸（C5）、丙酸（C3）的順序轉換，在第四次β-氧化循環的丙酸

4. 被分解時，香豆素衍生物被釋放出來。香豆素衍生物在405 nm激發下發出藍色熒光。

5. 由于游離的香豆素衍生物擴散到整個細胞中，因此通過檢測細胞內的藍色熒光強度，可以實時且定量的評價β-氧化活性。

※　通過添加肉堿穿梭抑制劑的Etomoxir，有效地抑制了細胞內的熒光上升。

※　該結果證明FAOBlue主要檢測線粒體的FAO活性。

◆特點

●　FAOBlue處于消光狀態，分解后的游離香豆素衍生物呈現出比分解前更高的熒光強度。

●　添加培養基后，30 min~120 min后便可觀察。

●　無需特別操作即可檢測β-氧化活性。

●　實例驗證能觀察多種細胞類型的β-氧化。

●　有抑制藥物依賴性β-氧化和因促進而引起的活性變化的成功檢測案例。

●　檢測波長：激發405 nm/熒光460 nm。

※　注意：

使用共聚焦激光顯微鏡時，推薦使用405 nm激光激發。如果本試劑在330～380 nm的范圍內激發的話，會觀察到無關FAO活性的370～450 nm（最大熒光波長410 nm）的熒光。使用熒光顯微鏡時，為了特異性觀察FAO活性，推薦選擇激發波長在390～430 nm范圍內的激發光濾光片。詳情請參考數據實例：FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化。

◆原著論文

Uchinomiya et. al., Chem. Commun. 56, 3023～3026 (2020) . ”Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells.”

◆應用

●　評價各種細胞的β-氧化活性

●　β-氧化相關的基因基礎研究

●　抑制或促進β-氧化的化合物的探索等

◆操作方法概況

1. 在HBS中溶解FAOBlue至終濃度為5~20 μM^*1。

*1 針對不同的細胞類型，合適的濃度有所差異。建議根據具體實驗進行探討。

2. 去除培養基，用HBS清洗細胞2次。

3. 向細胞添加含有FAOBlue的HBS。

4. 在37°C下培養30 min以上^*2。

*2 針對不同的細胞類型，合適的培養時長有所差異。建議根據具體實驗進行探討。

5. 更換培養基后^*3，通過成像觀察藍色熒光（Ex. 405 nm/Em. 430～480 nm）。

*3 染色后的培養基更換是非必須的。即使不清洗也可進行觀察。

實驗注意點

由于本試劑使用405 nm的激發光，根據不同的觀察對象，可能會觀察到其自發的熒光。建議同時進行未添加本試劑的陰性對照實驗。尤其是在顯微鏡下觀察到點狀熒光信號時，可能就是細胞的自發熒光。

◆應用實例

FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化

FAOBlue以及香豆素衍生物的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。

FAOBlue在通過FAO轉換成香豆素衍生物后，吸收最大值由350 nm變為405 nm的長波長。因此，在405 nm的激發條件下，FAOBlue不會發出熒光，只有在通過FAO釋放香豆素衍生物時才會發出藍色熒光。

※　注意：

若使用處于FAOBlue的吸收最大值350 nm左右的光激發，FAOBlue也會發出藍色熒光（380～450 nm；最大波長400 nm）。若在熒光顯微鏡中使用普通的DAPI濾光片，將會同時激發未反應的FAOBlue以及FAO反應后的香豆素衍生物。所以在選擇濾光片時請格外注意。

可視化各種細胞類型中的FAO活性

在4種癌細胞中加入FAOBlue，培養一定時間后進行熒光觀察。所有細胞都觀察到了藍色熒光，而添加FAO抑制劑etomoxir后熒光顯著衰減，由此可知，藍色熒光是由FAO活性引起的。

※ 各種細胞的實驗條件有所不同。

※ HepG2 : 5 μM, 30 min

※ LNCaP: 20 μM, 120 min

※ HeLa : 20 μM, 120 min

※ A549 : 5 μM, 30 min

觀察刺激依賴性β-氧化的變化

向HepG2細胞添加脂質代謝促進劑AICAR^*2（200 μM，3 h）或部分FAO抑制劑ranolazine（200 μM，12 h）進行前處理后，添加FAOBlue（5 μM）培養30 min。進行熒光觀察時，可以看到對比對照實驗（未處理），AICAR中熒光強度明顯增強，ranolazine中熒光強度明顯降低。

＊2 AICAR : AMPK（AMP-activated protein kinase）活化劑具有活化脂質代謝的功能。

藥物作用的定量分析

使用FAOBlue可以定量分析藥物對FAO的效果。用非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）的候選治療藥ND-630（acetyl-CoA carboxylase inhibitor）前處理HepG2細胞4 h后，添加FAOBlue（5 μM）培養30 min。使用共聚焦激光顯微鏡評價藍色熒光強度時，可以觀察到依賴于ND-630濃度的熒光強度增加。由此可知，ND-630增強了FAO的活性。

NASH模型小鼠分析

非酒精性肝炎（NASH）是一種與脂質相關的疾病，已知會降低脂肪分解的速度。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強脂質代謝的bezafibrate后，回收其肝臟制備初代培養肝細胞。向各個細胞加入FAOBlue（5 μM）觀察其FAO活性，結果顯示，對比正常小鼠來源細胞，NASH模型小鼠來源細胞的FAO活性明顯被抑制。另一方面，我們可以看到給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來源細胞中FAO恢復了活性。

本試劑可用于脂質相關疾病模型中的FAO定量分析。