可熒光定量活細胞的脂肪酸β-氧化(FAO)活性的試劑
FAOBlue
FAOBlue是一款可以通過藍色熒光可視化脂肪酸分解的共同途徑——脂肪酸β-氧化(FAO)的活性的試劑。
通過熒光成像,可以簡單地檢測出過去難以檢測的活細胞中的脂肪酸β-氧化活性。
該產品可廣泛應用于對比評估不同細胞種類之間的β-氧化,探索促進或抑制β-氧化活性的化合物,β-氧化相關酶群的基礎研究等領域。
※ 本產品基于九州大學研究生院藥學研究院藥物發現化學生物學領域 王子田彰夫教授的研究成果,
※ 由Funakoshi株式會社商品化并銷售。
※ 本產品僅供研究使用。
使用FAOBlue可視化HepG2細胞的FAO活性
添加FAOBlue到HepG2細胞中,觀察活細胞成像,可從細胞中觀察到藍色熒光。另一方面,若使用FAO抑制劑進行前處理,則熒光強度明顯減少,由此可知,藍色熒光的強度取決于FAO的活性。
◆何為脂肪酸β-氧化(Fatty acid beta-oxidation; FAO)
脂肪酸是構成細胞的各種脂質的基本要素,與葡萄糖、氨基酸并稱為能源。尤其是在葡萄糖不足而饑餓的時候,脂肪酸會分解活躍,產生大量的ATP。雖然脂肪酸根據碳鏈的長短以及不飽和度的差別而存在不同的種類,但是由于它的分解屬于線粒體等細胞器的共同分解途徑,因此這種途徑被統稱為脂肪酸β-氧化(Fatty acid beta-oxidation; FAO)。
脂肪酸β-氧化主要通過4步酶反應——1)脂肪酸β位的氧化,2)β位的水合,3)β位的氧化,4)裂解,被階段性分解為2個碳原子的短鏈脂肪酸和作為ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2個碳原子的短鏈脂肪酸再通過同一個循環,以2n個碳原子的短鏈脂肪酸重復分解。
研究提出,癌癥以及非酒精性肝炎(NASH)等疾病中,脂肪酸β-氧化會出現很大的變動,因此開發檢測脂肪酸β-氧化活性的方法備受期待。然而,在活細胞中檢測多種酶參與的脂肪酸β-氧化一直以來都十分困難。
FAOBlue是一款新型脂肪酸β-氧化應答型熒光探針,由九州大學研究生院藥學研究院、專攻藥物發現化學生物學領域的王子田彰夫教授開發。只需將產品添加到培養基中的簡單操作,便可以通過熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。
◆原理
FAOBlue是一種在碳原子數為9的壬酸的碳鏈末端添加了藍色熒光色素香豆素衍生物的化合物,此外,通過用乙酰氧基甲基酯保護末端脂肪酸來提高細胞膜透過性。雖然FAOBlue中含有香豆素衍生物,但是在該狀態下,它不會在405 nm激發下發出熒光。
1. 附著在羧基的乙酰氧甲基具有高疏水性,因此FAOBlue可以跨越細胞膜,有效地攝入到細胞中。
2. 通過細胞內的酯水解酶去除乙酰氧基甲酯,轉換成游離脂肪酸的形態。
3. 通過脂酰CoA合成酶轉換成脂酰CoA,攝入β-氧化途徑。
4. 通過β-氧化循環壬酸(C9)按庚酸(C7)、戊酸(C5)、丙酸(C3)的順序轉換,在第四次β-氧化循環的丙酸
4. 被分解時,香豆素衍生物被釋放出來。香豆素衍生物在405 nm激發下發出藍色熒光。
5. 由于游離的香豆素衍生物擴散到整個細胞中,因此通過檢測細胞內的藍色熒光強度,可以實時且定量的評價β-氧化活性。
※ 通過添加肉堿穿梭抑制劑的Etomoxir,有效地抑制了細胞內的熒光上升。
※ 該結果證明FAOBlue主要檢測線粒體的FAO活性。
◆特點
● FAOBlue處于消光狀態,分解后的游離香豆素衍生物呈現出比分解前更高的熒光強度。
● 添加培養基后,30 min~120 min后便可觀察。
● 無需特別操作即可檢測β-氧化活性。
● 實例驗證能觀察多種細胞類型的β-氧化。
● 有抑制藥物依賴性β-氧化和因促進而引起的活性變化的成功檢測案例。
● 檢測波長:激發405 nm/熒光460 nm。
※ 注意:
使用共聚焦激光顯微鏡時,推薦使用405 nm激光激發。如果本試劑在330~380 nm的范圍內激發的話,會觀察到無關FAO活性的370~450 nm(最大熒光波長410 nm)的熒光。使用熒光顯微鏡時,為了特異性觀察FAO活性,推薦選擇激發波長在390~430 nm范圍內的激發光濾光片。詳情請參考數據實例:FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化。
◆原著論文
Uchinomiya et. al., Chem. Commun. 56, 3023~3026 (2020) . ”Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Pathway in Living Cells.”
◆應用
● 評價各種細胞的β-氧化活性
● β-氧化相關的基因基礎研究
● 抑制或促進β-氧化的化合物的探索 等
◆操作方法概況
1. 在HBS中溶解FAOBlue至終濃度為5~20 μM*1。
*1 針對不同的細胞類型,合適的濃度有所差異。建議根據具體實驗進行探討。
2. 去除培養基,用HBS清洗細胞2次。
3. 向細胞添加含有FAOBlue的HBS。
4. 在37°C下培養30 min以上*2。
*2 針對不同的細胞類型,合適的培養時長有所差異。建議根據具體實驗進行探討。
5. 更換培養基后*3,通過成像觀察藍色熒光(Ex. 405 nm/Em. 430~480 nm)。
*3 染色后的培養基更換是非必須的。即使不清洗也可進行觀察。
實驗注意點
由于本試劑使用405 nm的激發光,根據不同的觀察對象,可能會觀察到其自發的熒光。建議同時進行未添加本試劑的陰性對照實驗。尤其是在顯微鏡下觀察到點狀熒光信號時,可能就是細胞的自發熒光。
◆應用實例
FAO特異性吸收光譜、熒光光譜的變化
FAOBlue以及香豆素衍生物的吸收光譜(左)和熒光光譜(右)。
FAOBlue在通過FAO轉換成香豆素衍生物后,吸收最大值由350 nm變為405 nm的長波長。因此,在405 nm的激發條件下,FAOBlue不會發出熒光,只有在通過FAO釋放香豆素衍生物時才會發出藍色熒光。
※ 注意:
若使用處于FAOBlue的吸收最大值350 nm左右的光激發,FAOBlue也會發出藍色熒光(380~450 nm;最大波長400 nm)。若在熒光顯微鏡中使用普通的DAPI濾光片,將會同時激發未反應的FAOBlue以及FAO反應后的香豆素衍生物。所以在選擇濾光片時請格外注意。
可視化各種細胞類型中的FAO活性
在4種癌細胞中加入FAOBlue,培養一定時間后進行熒光觀察。所有細胞都觀察到了藍色熒光,而添加FAO抑制劑etomoxir后熒光顯著衰減,由此可知,藍色熒光是由FAO活性引起的。
※ 各種細胞的實驗條件有所不同。
※ HepG2 : 5 μM, 30 min
※ LNCaP: 20 μM, 120 min
※ HeLa : 20 μM, 120 min
※ A549 : 5 μM, 30 min
觀察刺激依賴性β-氧化的變化
向HepG2細胞添加脂質代謝促進劑AICAR*2(200 μM,3 h)或部分FAO抑制劑ranolazine(200 μM,12 h)進行前處理后,添加FAOBlue(5 μM)培養30 min。進行熒光觀察時,可以看到對比對照實驗(未處理),AICAR中熒光強度明顯增強,ranolazine中熒光強度明顯降低。
*2 AICAR : AMPK(AMP-activated protein kinase)活化劑具有活化脂質代謝的功能。
藥物作用的定量分析
使用FAOBlue可以定量分析藥物對FAO的效果。用非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的候選治療藥ND-630(acetyl-CoA carboxylase inhibitor)前處理HepG2細胞4 h后,添加FAOBlue(5 μM)培養30 min。使用共聚焦激光顯微鏡評價藍色熒光強度時,可以觀察到依賴于ND-630濃度的熒光強度增加。由此可知,ND-630增強了FAO的活性。
NASH模型小鼠分析
非酒精性肝炎(NASH)是一種與脂質相關的疾病,已知會降低脂肪分解的速度。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強脂質代謝的bezafibrate后,回收其肝臟制備初代培養肝細胞。向各個細胞加入FAOBlue(5 μM)觀察其FAO活性,結果顯示,對比正常小鼠來源細胞,NASH模型小鼠來源細胞的FAO活性明顯被抑制。另一方面,我們可以看到給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來源細胞中FAO恢復了活性。
本試劑可用于脂質相關疾病模型中的FAO定量分析。
※ 本頁面產品僅供研究用,研究以外不可使用。
產品編號 |
產品名稱 |
產品規格 |
FDV-0033 |
FAOBlue (Fatty Acid Oxidation Detection Reagent)
FAOBlue 脂肪酸氧化檢測試劑 |
0.2 mg |