Cell：從結構上詳細闡明單結構域駱駝抗體可強效中和包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2在內的β冠狀病毒

來源：作者：人氣：-發表時間：2020-04-29 13:10:00【大中小】

冠狀病毒是一種有包膜的、正義RNA病毒，分為4個屬（α、β、γ和δ），可感染多種宿主生物。至少有7種冠狀病毒可引起人類疾病，其中4種病毒（HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-229E）在全球范圍內季節性地在人群中流行，在大多數患者中引起輕度呼吸道疾病。剩下的三種病毒，即SARS-CoV（也稱為SARS-CoV-1）、MERS-CoV和SARS-CoV-2，是人畜共患病的病原體，在人群中出現后，已經引起了流行病或大流行病，癥狀嚴重且往往是致命的。對于這些高致病性的β冠狀病毒，預防性和治療性的干預是需要的。
Cell：從結構上詳細闡明單結構域駱駝抗體可強效中和包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2在內的β冠狀病毒

冠狀病毒表面有刺突糖蛋白（S），它是一種大型I類融合蛋白。S蛋白形成了一個三聚體復合物，在功能上可分為兩個不同的由一個蛋白酶切割位點分隔開的亞基，即S1和S2。S1亞基包含受體結合結構域（RBD），它與宿主細胞受體蛋白相互作用，觸發膜融合。S2亞基包含膜融合復合物，包括疏水性融合肽和α-螺旋七肽重復區。SARS-CoV和MERS-CoV的功能性宿主細胞受體分別是血管緊張素轉換酶2（ACE2）和二肽基肽酶4（DPP4）。無論是在結構上還是在生物物理學上，這些受體與各自的RBD之間的相互作用已經被充分地表征了。最近，有報道稱SARS-CoV-2 S蛋白也利用ACE2作為功能性宿主細胞受體，并且已經報道了這種復合物的幾種結構。

最近在低溫電鏡（cryo-EM）方面的進展使得科學家們能夠確定這種三聚體刺突蛋白胞外域（ectodomain）的高分辨率結構，并了解S蛋白作為一種大分子機器的功能。對SARS-CoV刺突的初始低溫電鏡表征顯示它的RBD至少采用了兩種不同的構象。在 “向上（up）”構象中，RBD相對于S蛋白的其余部分向外突出，這樣，它們可以很容易地與ACE2結合而不發生立體沖突。在“向下（down）”構象中，RBD緊緊貼著S2亞基的頂部，防止被ACE2結合。隨后的實驗證實了這一現象，并且在MERS-CoV S蛋白、SARS-CoV-2 S蛋白和α冠狀病毒S蛋白中也觀察到了類似的動態。由于在向上構象的三個RBD中，通過低溫電鏡可以觀察到的顆粒豐度相對較低，因此有人認為這種構象可能對應于能量不穩定狀態。這些觀察結果讓人們提出冠狀病毒RBD可能作為分子棘輪發揮作用的假說：受體結合事件會將RBD保持在這種不太穩定的向下構象中，導致S1逐漸失去穩定，直到S2最終被觸發而啟動膜融合。最近的實驗表明靶向RBD的抗SARS-CoV抗體讓SARS-CoV RBD保持在這種向上構象中并導致它的融合前刺突失去穩定，從而為這一假說提供了支持。

人們已經報道了許多抗SARS-CoV RBD抗體和抗MERS-CoV RBD抗體，它們的中和機理可歸因于受體結合位點的封閉和讓RBD保持在這種不穩定的向上構象中，從而作為受體模擬物有效地觸發融合前構象過早地轉變到融合后構象。除常規抗體外，駱駝科動物還產生僅有重鏈的抗體（HCAb），其僅包含一個可變結構域（VHH）而不包含構成常規IgG抗體的抗原結合片段（Fab）的兩個可變結構域（VH和VL）。在沒有效應結構域的情況下，單個可變結構域被稱為單結構域抗體、VHH或納米抗體（Nanobody），通常可獲得與常規抗體相當的抗原親和力和特異性。VHH可以很容易地構建成多價形式，并且比大多數抗體具有更高的熱穩定性和化學穩定性。此外，已知VHH對空間障礙的敏感性較小，而空間障礙可能會阻止較大的常規抗體結合。它們的優越的生物物理特性已導致評估了幾種VHH抵抗呼吸道合胞病毒（RSV）等常見呼吸道病原體的療效。

在呼吸道感染中將VHH用作生物制劑是一種特別有吸引力的應用，這是因為可以將高度穩定的VHH霧化并通過吸入器直接施用于感染部位。此外，由于VHH在長時間保存后仍保持穩定，可以將它們儲存起來作為疫情爆發時的治療選擇。盡管迫切需要針對MERS-CoV和SARS-CoV-2的治療方法，但尚未充分探討為此目的使用VHH的可行性。已報道了通過對駱駝進行抗原免疫產生了幾種靶向MERS-CoV S蛋白的VHH，但是它們的表位除了被歸類為靶向RBD之外，在很大程度上仍然是未知的。

在一項新的研究中，來自比利時、美國和德國多家研究機構的研究人員分離出兩種分別可強效中和SARS-CoV RBD和MERS-CoV RBD的VHH。這兩種VHH分別是對美洲駝進行SARS-CoV S蛋白和MERS-CoV S蛋白免疫而觸發的。他們解析出這兩種VHH與它們各自的病毒表位形成復合物時的晶體結構，這表明中和機制可能是受體結合界面受到封閉和將RBD保持在向上構象中。相關研究結果以論文手稿的形式在線發表在Cell期刊上，論文標題為“Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-domain Camelid Antibodies”。

這些研究人員還發現這種靶向SARS-CoV RBD的VHH與SARS-CoV-2 RBD發生交叉反應，并且可以阻斷受體結合界面。在將這種VHH進行基因改造后成為二價Fc融合蛋白后，他們證實這種交叉反應性的VHH也可以中和攜帶SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒。他們進一步證實這種VHH-Fc融合蛋白可以在工業標準的CHO細胞系統中高產量產生，這表明作為正在進行的COVID-19大流行的潛在治療試劑，它值得進一步研究。

由此可見，這些研究人員從接受融合前保持穩定的MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白免疫的美洲駝中分離出兩種具有強效中和能力的VHH，并對它們進行了表征。這兩種VHH能夠與各自S蛋白的RBD高親和力地結合，能夠在體外中和表達各自S蛋白的假病毒。就他們所知，人們之前還沒有分離和表征SARS-CoV S蛋白特異性的VHH。幾種MERS-CoV S蛋白特異性的VHH已經被描述，它們都是靶向RBD的。這幾種VHH中的一些也已被報道可以阻斷DPP4結合，非常類似于MERS VHH-55。通過解析出這兩種新分離的VHH與各自的病毒靶點形成復合物時的晶體結構，他們提供了關于表位結合及其中和機制的詳細見解。

人們已描述了一些靶向RBD的常規抗體能夠中和SARS-CoV或MERS-CoV。MERS VHH-55的表位與一些靶向MERS-CoV RBD的抗體中的幾種---包括C2、MCA1、m336、JC57-14、D12、4C2和MERS-27---的表位重疊。除了最近描述的也能結合SARS-CoV S蛋白和SARS-CoV-2 S蛋白的CR3022之外，SARS VHH-72的表位與任何之前描述的抗體的表位沒有明顯重疊。

然而，與SARS VHH-72不同，CR3022不能阻止ACE2結合，并且它缺乏中和SARS-CoV-2的活性。盡管表位部分重疊，但是這種功能上的差異可能是由于這兩種抗體采用的接近角度不同。鑒于SARS VHH-72以納摩爾解離常數（nanomolar KD）結合到SARS-CoV S RBD的一部分表現出較低變異的序列上，而且正如它與WIV1-CoV和SARS-CoV-2 RBD存在交叉反應性所證實的那樣，它可能廣泛地結合來自其他SARS-CoV樣病毒的S蛋白。

這些研究人員表明，通過基因改造構建出二價VHH-72-Fc融合蛋白，他們可以補償單價SARS VHH-72的相對較高的解離常數。這種二價分子在瞬時轉染的ExpiCHO細胞中表達良好(~300 mg/L)，并且能夠在體外中和表達SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒。在未來利用現有的文庫和SARS-CoV-2 S進行的篩選工作可能會產生更強的中和劑。

由于VHH內在的熱穩定性和化學穩定性，它們已被研究作為一類潛在的治療性藥物來對抗多種疾病。之前已經報道了幾種靶向HIV和流感病毒的VHH，并且有多種靶向RSV的VHH已經被評估。通過霧化噴霧給送這些分子的可能性在呼吸道病原體的情況下特別有吸引力，這是因為VHH理論上可以直接被吸入到感染部位，以最大限度地提高它們的生物利用度和功能。鑒于目前缺乏治療MERS、SARS和COVID-19的方法，以及與冠狀病毒疫情大爆發相關的破壞性影響，人們急需預防性和治療性的干預措施。這些研究人員希望MERS VHH-55、SARS VHH-72和VHH-72-Fc因具有良好的生物物理特性和強大的中和能力，可以作為科學家們的有用試劑和潛在的候選治療性藥物。