UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2025-06-27 11:26:00【大中小】

UltraRIPA kit for Lipid Raft

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代 RIPA 緩沖液

與常規(guī)的非變性細(xì)胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100 等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質(zhì)。從常規(guī)緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質(zhì)功能的情況下能實(shí)現(xiàn)高效地提取，有利于對脂筏等蛋白質(zhì)的功能分析。

※本產(chǎn)品僅限于研究用。不可用于臨床治療。

◆細(xì)胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）

裂解細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析的時候，經(jīng)常會使用 RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）緩沖液和1% Triton X-100 緩沖液等的相對溫和的細(xì)胞膜裂解緩沖液。這些緩沖液對蛋白質(zhì)的構(gòu)造和功能的影響小，適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉降和各種結(jié)合實(shí)驗(yàn)等蛋白質(zhì)的功能分析。另一方面，與具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的 SDS 緩沖液相比，增溶能力較弱，完全不能溶解以脂筏（Lipid Raft）為主的細(xì)胞膜組分。許多表面活性劑都不能溶解脂筏，故其又被稱為 Detergent Resistant Membrane（DRM）。DRM中所含蛋白質(zhì)的功能分析被認(rèn)為是十分困難的。

脂筏（Lipid Raft）是由膽固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI錨定蛋白（GPI anchor protein）和棕櫚酰化（palmitoylation）蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜構(gòu)造，被認(rèn)為是整合各種功能蛋白的功能域。神經(jīng)細(xì)胞突觸和免疫細(xì)胞的免疫突觸是脂筏的代表性例子。

脂筏示意圖

◆特點(diǎn)

●	操作簡單，能快速提取脂筏蛋白
●	使用兩種類型的緩沖液（A buffer，B buffer）進(jìn)行兩個階段的提取。先提取出胞漿蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白
●	Buffer 提取的任何蛋白質(zhì)都不會失活
●	A buffer 和一般的 RIPA buffer 成分相同＊。B buffer 含有表面活性劑，可以通過透析除去
●	適用于哺乳動物細(xì)胞/組織
●	使用本品配制的溶解液適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA 法）、SDS-PAGE 和 Western blot 等
＊	1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate

◆緩沖液套裝組成

●　A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

●　B buffer（10 mL）

◆使用方法

1、	用 A buffer 溶解組織或培養(yǎng)細(xì)胞。
※	為了提高溶解效率，推薦使用均質(zhì)或超聲波破碎設(shè)備。
2、	進(jìn)行離心分離，使 A buffe r中可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀）分離，分別回收。上層清液 A buffer 可溶性組分中主要含有胞漿蛋白和非脂筏蛋白。
3、	往沉淀的 A buffer 不溶性組分中加入 B buffer，形成懸濁液。
4、	進(jìn)行離心分離，與步驟2一樣分離出可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀），分別回收。上層清液的 B buffer 可溶性組分中含有脂筏蛋白。
5、	可應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)。
※	A buffer 和 B buffer 不可用于 Bradford 法蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)定量請使用 BCA 檢測。
※	使用本品 A buffer 和 B buffer 進(jìn)行兩個階段的提取是最適宜的，也有只對細(xì)胞使用 B buffer 進(jìn)行溶解和提取的例子。具體請參照以下例子。

UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比較

	蛋白分離			蛋白結(jié)構(gòu)	蛋白功能	應(yīng)用
	胞質(zhì)蛋白	膜蛋白
	胞質(zhì)蛋白	非脂筏蛋白	脂筏蛋白
＞1%SDS buffer	○	○	○	╳	╳	SDS-PAGE
RIPA buffer	○	○	╳	○	○	酶分析法測定免疫沉淀 SDS-PAGE等
UltraRIPA	○	○	○	○	○	酶分析法測定免疫沉淀 SDS-PAGE等

◆應(yīng)用例

從脂筏中提取總蛋白

用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全腦組織后，回收 A buffer 不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer 進(jìn)行提取。提取后的總蛋白用 SDS-PAGE/銀染色檢測（左），用 BCA 法定量蛋白質(zhì)（右）。相對于具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的２% SDS 緩沖液，UltraRIPA kit 能夠提取 70% 以上的蛋白質(zhì)。

※不能保證全部蛋白質(zhì)的可溶性都得到改善。

脂筏標(biāo)記蛋白的提取

用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全腦組織后，回收 A buffer 不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer，提取后進(jìn)行 SDS-PAGE。利用對應(yīng)脂筏標(biāo)記蛋白的抗體進(jìn)行 Western blot 檢測。

脂筏標(biāo)記蛋白的免疫沉淀

用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全腦組織后，回收 A buffer 不溶性組分，通過 B buffer 提取脂筏標(biāo)記蛋白。對 buffer 提取物使用脂筏標(biāo)記蛋白 PSD95 的抗體和Ｇ蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫沉淀。使用銀染色和抗 PSD95 抗體通過 Western blot 檢測進(jìn)行確認(rèn)。

提取的蛋白質(zhì)的酶活性測定

用１%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和２%SDS 溶解 CHO 細(xì)胞，測定溶解物中乳酸脫氫酶（LDH）的活性。２%SDS 具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用，在幾乎完全失活的情況下，１% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和 UltraRIPA kit B buffer 所得的酶活性大致相同。

從脂筏中提取功能蛋白

用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全腦組織后，回收 A buffer 不溶性組分。用 A buffer 分三次沖洗不溶性組分，消除 RIPA 可溶性組分中脫磷酸酶的活性。往不溶性組分中分別添加２% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和 B buffer，測定各種提取物的總脫磷酸化酶活性。下圖是各緩沖液從 RIPA 不溶性組分中提取的蛋白質(zhì)的量（左軸：黑）和所檢測的脫磷酸酶的活性（右軸：紅）的示意圖。２% SDS buffer 能夠從 RIPA 不溶性組分中很好地提取蛋白質(zhì)，但容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，完全失去脫磷酸化活性。RIPA buffer 不能提取蛋白質(zhì)，活性也無法檢測。UltraRIPA kit B buffer 所提取的蛋白質(zhì)大約為２% SDS buffer 的 70%，且可以檢測出較強(qiáng)的脫磷酸化活性。

UltraRIPA kit B buffer 單獨(dú)提取脂筏蛋白的可能性評價

※數(shù)據(jù)提供：東京大學(xué)藥學(xué)院研究生院保健化學(xué)系

用 PBS 沖洗 COS-1 細(xì)胞，分別使用 SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和 UltraRIPA kit B buffer裂解，通過離心分離（14,000 rpm，5 min，4℃）可溶性組分和不可溶性組分。不可溶性組分用等量的 SDS-PAGE 樣品緩沖液變性溶解。脂筏標(biāo)記 Flotilin1 的可溶部分通過 SDS-PAGE/western blot 測定。使用１% Triton X-100 和 RIPA buffer，大部分的 Flotilin 1 不溶性膜組分沒有被溶解，而 UltraRIPA kit B buffer 幾乎可以全部溶解。

◆各buffer組成

●	SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）
●	UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，150 mM NaCl， 0.5％ Sodium Deoxycholate)
●	UltraRIPA kit B buffer (成分保密)
●	1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150mM NaCl）