羊駝事件后續-Jackson二抗常見應用之多重標記（Multiple-Labeling）

來源：作者：人氣：-發表時間：2018-05-21 09:21:00【大中小】

上回說到，Jackson的羊駝二抗均適用于多重標記，當然，不僅僅是羊駝，Jackson還有驢、山羊、小鼠等物種，可以提供更多選擇。

多重標記（Multiple-Labeling）的原理

利用免疫學和細胞化學原理，在同一張切片上同時或先后采用不同的熒光色素來原位示蹤組織或細胞內不同抗原大分子物質的一項標記染色技術。此項技術可以在同一張切片上顯示多種不同抗原成分（定性、定位、定量），因而使組織內不同抗原成分相互間功能關系的觀察更為直觀。

多重標記（Multiple-Labeling）的二抗選擇

在多重標記（Multiple-Labeling）實驗中，因為前后重染色劑間有交叉干擾，以及可能會產生的非特異性雜交，所以，二抗的選擇至關重要。

熒光顏色的選擇

紅色和綠色的區分度較大，效果也比較理想，是常見的兩種熒光選擇。綠色熒光染料通常有Cy2、FITC、Dylight 488、Alexa Flour 488，紅色熒光染料則有Cy3、Rhodamine、Dylight 594、Cy5、APC等。因為綠色和紅色熒光重合后顯示的是黃色，而橙色、黃色、紅色的很接近，因此三標的時候，一般選擇藍色熒光。藍色熒光染料一般為AMCA或Dlight 405。

二抗類型的選擇

因為要檢測一個以上的抗原，所以二抗至少要滿足以下條件：a. 不相互識別（來源于相同的物種）；b. 不識別實驗系統中其他的一抗；c.不識別實驗系統中其他物種的免疫球蛋白；d. 不識別樣品中內源性的免疫球蛋白。Jackson可用于多重標記的熒光二抗，都經過相近物種血清吸附處理，其針對目的種屬的特異性很高，同時針對其他非目的種屬的抗體分子的非特異性結合降到低值，同時避免了二抗與樣本以及其它一抗的非特異性雜交。

多重標記（Multiple-Labeling）的實驗示意圖

以小鼠組織切片，免疫熒光三標實驗為例

注意：每一步后徹底清洗，包括在第1步阻斷后。在沉重的或持續的背景下，在步驟4和步驟7可能需要進一步的阻斷。不要用正常血清稀釋抗體或混合抗體以節省時間。

在這個案例中，步驟3, 6和9中使用的二抗彼此不識別，因為它們都是驢制造的。它們已經被固相吸附，使得它們不識別在步驟2, 5和8中使用的其他主抗體。此外，它們不與可能存在于小鼠組織中的內源性小鼠IgG反應。

常用的多重標記（Multiple-Labeling）二抗產品列表

標記物	驢抗山羊 IgG (H+L)二抗（經雞，豚鼠，倉鼠，馬，人，小鼠，兔，大鼠血清吸附）	山羊抗小鼠IgG (H+L) 二抗（經人，牛，馬，兔，豬血清吸附）	驢抗兔 IgG (H+L) 二抗（經牛，雞，山羊，豚鼠，倉鼠，馬，人，小鼠，大鼠，綿羊血清吸附）
未標記	1.0 mg 705-005-147	1.5 mg 115-005-146	1.0 mg 711-005-152
辣根過氧化物酶	0.5 ml 705-035-147	1.5 ml 115-035-146	0.5 ml 711-035-152
堿性磷酸酶	0.5 ml 705-055-147	1.0 ml 115-055-146	0.5 ml 711-055-152
生物素	0.5 ml 705-065-147	1.5 ml 115-065-146	0.5 ml 711-065-152
DyLight™ 405	0.5 mg 705-475-147	1.0 mg 115-475-146	0.5 mg 711-475-152
AMCA	0.5 mg 705-155-147	1.5 mg 115-155-146	0.5 mg 711-155-152
Cy™ 2	0.5 mg 705-225-147	1.5 mg 115-225-146	0.5 mg 711-225-152
Alexa Fluor® 488	0.5 mg 705-545-147	1.0 mg 115-545-146	0.5 mg 711-545-152
Fluorescein (FITC)	0.5 mg 705-095-147	1.5 mg 115-095-146	0.5 mg 711-095-152
Cy™ 3	0.5 mg 705-165-147	1.5 mg 115-165-146	0.5 mg 711-165-152
Rhodamine (TRITC)	0.5 mg 705-025-147	1.5 mg 115-025-146	0.5 mg 711-025-152
Rhodamine Red-X™	0.5 mg 705-295-147	1.5 mg 115-295-146	0.5 mg 711-295-152
Alexa Fluor® 594	0.5 mg 705-585-147	1.0 mg 115-585-146	0.5 mg 711-585-152
Cy™ 5	0.5 mg 705-175-147	1.5 mg 115-175-146	0.5 mg 711-175-152
Alexa Fluor® 647	0.5 mg 705-605-147	1.0 mg 115-605-146	0.5 mg 711-605-152