重磅！Nature和Science同日打擂臺發表新型DNA/RNA堿基編輯器，可校正點突變

來源：作者：人氣：-發表時間：2017-10-27 09:34:00【大中小】

自從5年前CRISPR熱潮開始以來，科學家們就競相開發這種強大工具的更加全面或高效的版本，從而能夠極大地簡化DNA編輯。本周發表在Science期刊和Nature期刊上的兩項研究進一步擴大了CRISPR的使用范圍，開發出一種更加微妙的被稱作堿基編輯（base editing）的方法來修復遺傳物質：一項研究擴展了一種編輯DNA的策略，而另一項研究通過對RNA進行堿基編輯而開辟了新的領域

堿基編輯（base editing）與CRISPR的比較
圖片來自 C. BICKEL/SCIENCE

這兩項研究都為遺傳研究和甚至治愈疾病開辟了新的途徑。作為這篇最新的Nature論文的共同作者，美國哈佛大學化學家David Liu說，“人們不應認為堿基編輯比CRISPR更好---它們只是不同而已。這就像是問一艘船或一輛車哪個更好。”在2016年發表在Nature期刊上的一篇論文中，Liu開創了DNA堿基編輯技術[3]（參見新聞報道：三篇Nature文章揭示CRISPR/Cas9基因組編輯取得重大進展）。

CRISPR是由一種原始的細菌免疫系統改編而成的，它的作用方式是首先在基因組的一個靶位點上切割雙鏈DNA。相比之下，堿基編輯并不切割DNA雙螺旋，而是在組成DNA或RNA的四個堿基中，利用酶精確地重新排列其中的一個堿基上的一些原子，從而將這個堿基轉化為一個不同的堿基，同時不改變其周圍的堿基。這種能力大大增加了改變遺傳物質的選擇手段。美國馬薩諸塞大學醫學院CRISPR研究員Erik Sontheimer說，“這是一種很有價值的補充，應當會占有一席之地。”

很多人類疾病是由單堿基突變引起的。CRISPR很難高效地和干凈利落地校正這些所謂的點突變，因此堿基突變可能提供一種更加有效的方法。在Liu的初次報道之后，中國的一個研究小組利用DNA堿基編輯技術校正人從一名患有遺傳性血液疾病的病人中克隆出的人胚胎內的一種致病性突變（參見新聞報道：Science：基因編輯療法在中國已占先機，在癌癥、遺傳病治療等領域 9 項試驗值得關注）[4]。

常規的CRISPR利用與一種核酸酶（最常見的是Cas9）結合在一起的向導RNA（gRNA），結合到特定的一段DNA堿基上；這種核酸酶隨后切割DNA雙螺旋。一種細胞修復機制試圖重新連接這些被切斷的DNA末端，但是有時也會插入或剔除堿基，這就使得DNA代碼出現亂碼，并且能夠敲除一個靶基因。美國布羅德研究所CRISPR研究員張鋒（Feng Zhang）說，“基于核酸酶的基因編輯非常適合用于讓基因失活。”

然而，他指出，CRISPR“在作出精確的改變時效率并不高”。為了修復一個點突變，CRISPR-Cas9系統還必須引入一個具有正確堿基的“供者”DNA鏈，隨后還要依賴于另一種被稱作同源介導修復（homology-directed repair, HDR）的細胞機制。但是除非細胞發生分裂，HDR的修復效率比較差，這意味著這種策略不能在腦細胞和肌肉細胞中發揮作用，這是因為這些細胞不再自我復制。即便在分裂細胞（dividing cells）中，供者DNA也很少會插入這個切割位點。

校正點突變

堿基編輯器借用CRISPR的組分---gRNA和Cas9或其他的核酸酶，但并不切割DNA雙螺旋，而且利用TadA和ADAR等脫氨酶以化學方式改變單個堿基。

大量借用CRISPR工具包的堿基編輯系統很容易在非分裂細胞（nondividing cells）中實現堿基編輯。DNA具有4個核苷酸堿基：A、C、T和G，堿基編輯會將一個堿基改變為另一個堿基。在Liu的2016年那項研究中，他的團隊將gRNA與一個“死的”Cas9（dCas9）融合在一起，dCas9不能夠切割整個DNA雙螺旋，但是仍然能夠在正確的位點上讓它解鏈。這些研究人員將酶APOBEC1附著到gRNA-dCas9上，這會觸發一系列化學反應，最終導致堿基C改變為堿基T。DNA的堿基配對規則控制著隨后的堿基變化。這種配對規則規定一條DNA鏈上的T與另一條DNA鏈上的A配對。dCas9經進一步修飾后在未編輯的DNA鏈上產生切口，從而激活細胞的DNA修復機制，將初始與堿基C配對的堿基G轉化為與這個新產生的T配對的A。

這第一個DNA堿基編輯器并不能夠解決與人類疾病相關的最為常見的點突變（大約占一半）：在應當為G•C的地方存在著A•T。如今，來自Liu團隊的這個新的編輯器能夠修復這種點突變。該團隊再次將gRNA與dCas9融合在一起，但是已知沒有一種能夠將A轉化為G的酶。因此，他們利用來自大腸桿菌的酶TadA開出一種新型酶。這種新型酶將A轉化為一種被稱作肌苷（inosine, I）的堿基。隨后不論是一種細胞修復機制，還是DNA自我復制過程，都會將I變成G。美國哈佛大學CRISPR研究員George Church說，“在這項研究中，重要的事情是對TadA酶進行基因改造讓它具備某種非天然的功能。我佩服他們。”

張鋒團隊通過將gRNA與一種不同的沒有切割活性的核酸酶dCas13和一種將RNA中的A轉化為I的天然性酶融合在一起而構建出一種RNA堿基編輯器。與DNA中不同的是，這不會導致隨后的堿基變化。含I的RNA僅像那個位點上存在一個G那樣發揮作用。

鑒于RNA將來自DNA的遺傳信息傳遞給細胞中的蛋白制造工廠，或者能夠直接執行著基因調節之類的作用，它也是一種很有吸引力的治療靶標。但是RNA僅在細胞中短暫地存在。這意味著可能需要重復地給藥才會使得RNA堿基編輯器作為一種藥物發揮效果，張鋒團隊提出這可能對短暫的癥狀（如局部炎癥）有意義。

盡管RNA的較短壽命使得RNA堿基編輯對很多療法并不那么有吸引力，但是Sontheimer也從中觀察到好處。他說，“在某些方面，作用于RNA是更加安全的。”科學家們擔心利用DNA堿基編輯器進行基因編輯可能會意外地影響基因組的錯誤部分---這一變化將是永久存在的。Sontheimer說，“利用RNA堿基編輯器進行堿基編輯，如果存在一定程度的脫靶效應，那么也不會將這些錯誤永久性地蝕刻在基因組中。”

Church說，針對堿基編輯是否比CRISPR和其他的改變核酸的技術更有優勢，應當“逐案地”加以評估。他注意到，“在此之前，這聽起來就像是改變堿基是不可能的。事實上，這是較為困難的，或者僅僅是效率較低的。”

張峰和Liu強調，在堿基編輯療法進入臨床試驗之前，可能需要數年的時間，而且可能需要更長的時間才確定這種策略是否比現存的基因療法更有優勢。Liu說，“作出堿基編輯將是一種比人體基因療法更好的方法的結論在科學上是短視的，而且就長期而言也是不正確的。”不過，如今已經清楚的是，作為標準CRISPR的強大替代性方法，堿基編輯如今已在游戲中了。

文章來源

[1].Nicole M. Gaudelli, Alexis C. Komor, Holly A. Rees, Michael S. Packer, Ahmed H. Badran, David I. Bryson & David R. Liu. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, Published online 25 October 2017, doi:10.1038/nature24644

[2].David B. T. Cox, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Brian Franklin, Max J. Kellner, Julia Joung, Feng Zhang. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science, Published online:25 Oct 2017, doi:10.1126/science.aaq0180

[3].Alexis C. Komor, Yongjoo B. Kim, Michael S. Packer, John A. Zuris & David R. Liu. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, Published online 20 April 2016, doi:10.1038/nature17946

[4].Dennis Normile. China sprints ahead in CRISPR therapy race. Science, 06 Oct 2017, doi:10.1126/science.358.6359.20