CRISPR從哪兒來(lái)

諸如CRISPR–Cas等系統(tǒng)的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)顯而易見，原核生物，比如細(xì)菌和古細(xì)菌，都會(huì)面對(duì)遺傳入侵者的強(qiáng)烈攻擊，而病毒會(huì)以遠(yuǎn)超細(xì)菌的數(shù)量來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行剿滅，而原核生物常常會(huì)交換一些片段，比如質(zhì)粒，其能夠吞噬來(lái)自宿主的資源，并且驅(qū)動(dòng)宿主自我毀滅；與此同時(shí)原核生物還會(huì)進(jìn)化出大量“武器”來(lái)應(yīng)對(duì)病毒等外界威脅，比如限制性內(nèi)切酶，其就是一種能夠切斷特殊位點(diǎn)或附近DNA的蛋白質(zhì)，但原核生物的這些防御工事并不是很“鋒利”，每一種酶都會(huì)被編程識(shí)別特定的序列，而當(dāng)存在合適基因的拷貝時(shí)才會(huì)為微生物提供保護(hù)作用，而CRISPR–Cas系統(tǒng)就具有動(dòng)態(tài)性的變化，其能夠適應(yīng)并且記住特殊遺傳特性的外來(lái)入侵者，而這種方式就類似于在感染后人類機(jī)體抗體提供的長(zhǎng)效免疫保護(hù)力一樣，來(lái)自荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的研究者John van der Oost表示，當(dāng)我們首次聽到這種假設(shè)時(shí)，我們認(rèn)為這對(duì)于簡(jiǎn)單的原核生物而言非常復(fù)雜。

隨后當(dāng)研究者M(jìn)ojica及其同事觀察到CRISPR的回文重復(fù)序列有時(shí)候能同病毒基因組進(jìn)行匹配時(shí)，他們對(duì)CRISPR–Cas系統(tǒng)的功能進(jìn)行了解析，從那時(shí)候開始，研究人員就開始對(duì)CRISPR相關(guān)的特殊蛋白（Cas蛋白）進(jìn)行研究，當(dāng)細(xì)菌遭受特殊病毒或質(zhì)粒時(shí)，這種特殊蛋白能夠?qū)㈤g隔區(qū)序列添加到細(xì)菌的基因組中，而間隔區(qū)序列制造的RNA還能夠指導(dǎo)其它Cas蛋白切割外來(lái)DNA或RNA。

那么細(xì)菌和古細(xì)菌是如何擁有這些復(fù)雜免疫系統(tǒng)的呢？這個(gè)問(wèn)題還有待于科學(xué)家進(jìn)一步研究解答，如今一種主流的理論認(rèn)為，基于轉(zhuǎn)座子（跳躍基因）的系統(tǒng)能夠從基因組中的一個(gè)位點(diǎn)跳躍到另一個(gè)位點(diǎn)；進(jìn)化生物學(xué)家Eugene Koonin及其同事通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了一類能夠編碼Cas1蛋白的遺傳移動(dòng)元件，該元件能夠插入到基因組的間隔區(qū)域中去，而這些“casposons”元件或許也是CRISPR–Cas免疫力的起源，如今研究者正在通過(guò)研究理解這些少量的DNA如何從一個(gè)位點(diǎn)跳躍到另一個(gè)位點(diǎn)，隨后他們將繼續(xù)通過(guò)研究追蹤誘發(fā)CRISPR–Cas系統(tǒng)變得復(fù)雜的分子機(jī)制。

CRISPR如何工作的

近些年來(lái)科學(xué)家們通過(guò)研究闡明了Cas蛋白添加間隔區(qū)的多種分子機(jī)制，但病毒的DNA在化學(xué)結(jié)構(gòu)上同宿主的DNA幾乎相同，那么蛋白質(zhì)如何知道哪種DNA能夠被添加到CRISPR–Cas記憶系統(tǒng)中呢？

這樣的“賭注”往往是很高的，如果細(xì)菌添加了自身的DNA片段，自身免疫攻擊就會(huì)增加自殺的風(fēng)險(xiǎn)，因此細(xì)菌和古細(xì)菌有時(shí)候就會(huì)吸收一些錯(cuò)誤，如果細(xì)胞在遭受病毒攻擊后依然生長(zhǎng)旺盛的話，少數(shù)細(xì)胞自殺可能并不太重要。實(shí)際上，當(dāng)病毒潛入細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)中時(shí)，僅有千萬(wàn)分之一的細(xì)菌會(huì)獲得能夠?yàn)樽陨矸烙拈g隔區(qū)，而且研究者對(duì)于研究驅(qū)動(dòng)間隔區(qū)的機(jī)制也非常困難。

研究者表示，如何有效識(shí)別合適的間隔區(qū)非常重要，有些研究就表明，包含CRISPR–Cas分子機(jī)器的細(xì)胞或許能夠充當(dāng)多種多樣的記錄設(shè)備，其能夠?qū)τ龅竭^(guò)的DNA和RNA序列進(jìn)行分類，這就能夠幫助研究人員追蹤細(xì)胞中基因的表達(dá)或?qū)Νh(huán)境化學(xué)物質(zhì)的暴露情況；研究人員還想通過(guò)研究來(lái)闡明細(xì)菌中的這種古老記憶如何被修改，很多攜帶CRISPR–Cas系統(tǒng)的微生物都包含有十幾個(gè)間隔區(qū)，而有些微生物則僅有1個(gè)間隔區(qū)，相比較而言，嗜熱古細(xì)菌將其1%的基因組貢獻(xiàn)給了5個(gè)CRISPR–Cas系統(tǒng)，其中包括458個(gè)間隔區(qū)。

目前在尋找古老間隔區(qū)上研究者積極性并不高，如果病毒會(huì)發(fā)生來(lái)避免CRISPR–Cas，那么間隔區(qū)或許就會(huì)退化，而且其或許會(huì)成為微生物保持額外DNA的負(fù)擔(dān)。

一些間隔區(qū)的起源還會(huì)展現(xiàn)出另外一些奧秘，目前研究人員在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，不到3%的間隔區(qū)能夠同一些已知的序列相匹配。大部分的測(cè)序結(jié)果都主要集中于受感染的人、牲畜或作物；在某些細(xì)菌中，CRISPR–Cas組分能夠控制DNA的修復(fù)、基因表達(dá)和生物被膜的形成，其同時(shí)還能夠幫助確定細(xì)菌感染諸如嗜肺軍團(tuán)菌等其它細(xì)菌的能力，嗜肺軍團(tuán)菌能夠誘發(fā)軍團(tuán)病，該菌必須含有Cas2蛋白來(lái)感染其天然宿主—變形蟲。

研究者Erik Sontheimer表示，研究人員同時(shí)還做出了一個(gè)平行的發(fā)現(xiàn)，那就是RNA干擾技術(shù)，該技術(shù)能夠沉默植物、動(dòng)物以及其它非原核生物有機(jī)體中的基因表達(dá)，之前研究者認(rèn)為RNA干擾是有機(jī)體中的一種天然防御機(jī)制，此后研究者才注意到RNA干擾在調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)中所扮演的角色。代爾夫特理工大學(xué)的研究人員Stan Brouns表示，這或許能夠解釋為何某些間隔區(qū)并不能夠與病毒或質(zhì)粒進(jìn)行匹配。

某些微生物能夠使用CRISPR–Cas系統(tǒng)

不論CRISPR–Cas系統(tǒng)是否還具有其它功能，目前很明確的是，相比其它微生物而言，有些微生物能夠很好利用該系統(tǒng)，有超過(guò)90%的古細(xì)菌都有基于CRISPR的免疫力，然而僅有三分之一被測(cè)序的細(xì)菌會(huì)被該系統(tǒng)所干擾。

大量的輸血模型和早期的實(shí)驗(yàn)室研究都表明，CRISPR–Cas可能具有更多的優(yōu)勢(shì)，尤其是當(dāng)同一些病毒做斗爭(zhēng)的時(shí)候尤為明顯，當(dāng)添加的DNA轉(zhuǎn)變成為基因組負(fù)擔(dān)之前，CRISPR–Cas系統(tǒng)的間隔區(qū)往往能夠記錄非常有限數(shù)量的病毒序列，如果環(huán)境中病毒的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)可能的間隔區(qū)數(shù)量時(shí)，CRISPR–Cas可能就沒有那么有用了；另外一種可能性就是外部環(huán)境中的古細(xì)菌并不會(huì)依賴其它的防御手段，細(xì)菌抵御外來(lái)入侵者的常用方法就是對(duì)細(xì)菌外膜進(jìn)行突變，而某些古細(xì)菌并不能夠自由地修補(bǔ)這些外膜，因?yàn)橥饽そY(jié)構(gòu)對(duì)于其在極端環(huán)境下生存只管中喲啊，這就使得諸如CRISPR的替代系統(tǒng)變得更加重要了。

人們更傾向于關(guān)注CRISPR–Cas9系統(tǒng)，因?yàn)樵撓到y(tǒng)在基因組編輯上具有簡(jiǎn)單性和多樣性，但微生物并不會(huì)對(duì)其偏愛，相反其會(huì)將該系統(tǒng)與其它不同的系統(tǒng)混合并且匹配，從而快速?gòu)钠渌?xì)菌中選出新型系統(tǒng)而剔除掉古老的系統(tǒng)。

如今研究者正式鑒別出了6種不同類型的CRISPR系統(tǒng)，包括19個(gè)亞型，然而研究者僅僅知道其中一部分工作的機(jī)制。闡明這些CRISPR系統(tǒng)的工作機(jī)制對(duì)于研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的新型生物技術(shù)應(yīng)用非常關(guān)鍵，比如研究者們所鐘愛的CRISPR-Cas9就是一種II型系統(tǒng)，其能夠利用間隔區(qū)轉(zhuǎn)錄的RNA分子來(lái)指導(dǎo)酶類對(duì)外來(lái)病毒和質(zhì)粒DNA進(jìn)行切割，但去年研究人員發(fā)現(xiàn)的VI型系統(tǒng)中的酶類卻能夠切割RNA，而且該系統(tǒng)中包含有和CRISPR-Cas9相關(guān)的某些基因，但同時(shí)又缺少能夠插入到間隔區(qū)中的一些重復(fù)序列。

研究者Doudna表示，III型系統(tǒng)就是研究者發(fā)現(xiàn)的最為常見的CRISPR–Cas系統(tǒng)，目前有研究證據(jù)表明，CRISPR–Cas并不會(huì)對(duì)外來(lái)DNA或RNA產(chǎn)生反應(yīng)，但卻會(huì)對(duì)DNA轉(zhuǎn)錄到RNA的過(guò)程產(chǎn)生反應(yīng)，如果被證明這是事實(shí)的話，那么其或許能夠作為一種新型的調(diào)節(jié)形式來(lái)擴(kuò)展CRISPR-Cas9用于基因組編輯的“工具箱”。

對(duì)于研究者M(jìn)ojica而言，深入剖析和CRISPR相關(guān)的諸多基本問(wèn)題往往比進(jìn)行革命性的研究發(fā)現(xiàn)要更有吸引力，他癡迷于CRISPR-Cas9研究已經(jīng)將近25年了，但后期他們還需要在這一領(lǐng)域內(nèi)進(jìn)行更多的研究。Mojica說(shuō)道，我知道這是一種強(qiáng)大的工具，其能夠用來(lái)治療多種人類疾病，但我更關(guān)心的是闡明該系統(tǒng)如何自始至終地進(jìn)行工作的。

【1】Five big mysteries about CRISPR’s origins

【2】Casposons： a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity
BMC Biology DOI： 10.1186/1741-7007-12-36

【3】Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity
Nature doi：10.1038/nature14237

【4】Molecular recordings by directed CRISPR spacer acquisition
Science DOI： 10.1126/science.aaf1175

【5】Viral Diversity Threshold for Adaptive Immunity in Prokaryotes
mBio doi： 10.1128/mBio.00456-12

【6】Biochemical studies of tast sensation. Binding of L-[3H]alanine to a sedimentable fraction from catfish barbel epithelium.
J Biol Chem https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/403？dopt=Abstract&holding=npg

【7】C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
Science DOI： 10.1126/science.aaf5573