基因編輯器CRISPR的產(chǎn)生和發(fā)展

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2016-11-24 09:42:00【大中小】

最先提出使用工具的人Michael Wiles

2013年年初，Michael Wiles同美國(guó)緬因州杰克遜實(shí)驗(yàn)室的高層管理者坐在一起，并且告訴了他們一種擁有驚人威力的DNA剪切新方法。這家簡(jiǎn)稱為JAX的實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)改造以JAXR Mice為注冊(cè)商標(biāo)的小鼠，并將其出售給研究人員。它喜歡這樣自夸：這“是全世界質(zhì)量最好和發(fā)表次數(shù)最多的小鼠模型”。Wiles為該實(shí)驗(yàn)室評(píng)估和研發(fā)新技術(shù)。他相信，這個(gè)由細(xì)菌和古生菌用于保護(hù)自身免受病毒侵襲的免疫策略巧妙改編而來(lái)的新工具將使JAX改造小鼠的方式發(fā)生革命性變化。“在場(chǎng)的十幾個(gè)人中，有9個(gè)人睡著了。”Wiles表示，“當(dāng)時(shí)沒(méi)人聽(tīng)說(shuō)過(guò)CRISPR。”

最先提出使用CRISPR工具的人Michael Wiles

Rudolf Jaenisch 在1974 年培育出首個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠，并且首次證明了CRISPR 在產(chǎn)生基因敲除小鼠方面的威力

如今，絕大多數(shù)小鼠培育者都知道CRISPR。長(zhǎng)久以來(lái)，JAX和其他培育新的小鼠品系的實(shí)驗(yàn)室依賴于一個(gè)辛苦費(fèi)力的多步驟過(guò)程，其中涉及利用基因工程技術(shù)改變小鼠的胚胎干細(xì)胞，將其注射進(jìn)胚胎，并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團(tuán)隊(duì)，也需要用2年時(shí)間才能成功改造一只小鼠。CRISPR利用一種可在受精卵上開(kāi)展針對(duì)性基因手術(shù)的分子復(fù)合物替代了所有這一切。它能在6個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生一種被改造的小鼠。

通過(guò)基因改造使基因被敲除或遺傳信息被添加進(jìn)來(lái)的小鼠，成為從癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化到阿爾茨海默氏癥、骨關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮癥和帕金森氏癥等一系列人類疾病的關(guān)鍵研究模型。基因敲除和敲入小鼠還為研究特定基因的功能提供了一種強(qiáng)大的工具。

“當(dāng)你在以前培育基因敲除小鼠時(shí)，需要具備一些技能。”來(lái)自麻省理工學(xué)院的Rudolf Jaenisch表示，“現(xiàn)在，你不再需要這些技能。任何傻瓜都能做。”

在科學(xué)界影響巨大

CRISPR代表的是“成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列”。它源自原核生物遺傳物質(zhì)，并且是對(duì)后者的一種描述。CRISPR利用向?qū)NA將生物“剪刀”（通常是和CRISPR相關(guān)的蛋白——Cas9）傳送到基因組中的某個(gè)精確位置。一旦Cas9通過(guò)酶解進(jìn)行了剪切，細(xì)胞便會(huì)嘗試愈合受傷的DNA。一種修復(fù)機(jī)制會(huì)導(dǎo)致基因敲除，而另一種會(huì)導(dǎo)致基因敲入。“CRISPR所做的全部事情是剪切DNA。”Wiles介紹說(shuō)，“其他一些事情都是細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)完成的。這就是我們能搭便車的地方。”

細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)是試圖將斷點(diǎn)處的雙鏈DNA重新拼接起來(lái)。這通常需要吞噬掉或添加一些堿基，從而導(dǎo)致基因插入或刪除。實(shí)際上，這種修復(fù)努力會(huì)將一些小“排印錯(cuò)誤”引入DNA文本，從而使基因喪失功能。

CRISPR基因敲除

Jaenisch首次證明了CRISPR在產(chǎn)生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人員首次證實(shí)CRISPR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中奏效的5個(gè)月后，Jaenisch和同事于2013年5月在《細(xì)胞》雜志上發(fā)表了一篇論文。他們報(bào)告稱，該技術(shù)成功斷開(kāi)了一組小鼠胚胎干細(xì)胞中的5個(gè)基因，而這在以前是不可能的。更重要的是，他們證實(shí)可完全繞過(guò)胚胎干細(xì)胞，并且同時(shí)敲除單細(xì)胞小鼠受精卵中的兩個(gè)基因。研究人員不再需要改造胚胎干細(xì)胞并不辭辛苦地培育若干代小鼠，以產(chǎn)生卵子或精子細(xì)胞中攜帶基因突變的小鼠。同時(shí)，研究人員若想培育擁有兩個(gè)突變的小鼠，也不再需要將單突變體雜交并經(jīng)歷一個(gè)類似的耗時(shí)且煩瑣的流程，以獲得擁有被改變生殖細(xì)胞系的小鼠后代。

革命性意義

CRISPR的影響不能僅通過(guò)節(jié)省成本來(lái)衡量。此項(xiàng)技術(shù)的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成為可能，從而解決了來(lái)自多倫多病童醫(yī)院的C. C. Hui最近面臨的特定問(wèn)題：在基因敲除過(guò)程中，缺失基因未產(chǎn)生任何可觀察到的效應(yīng)。Hui意識(shí)到，被敲除的基因同另一個(gè)可能對(duì)其作出補(bǔ)償?shù)幕虼嬖陉P(guān)聯(lián)。他向在多倫多表型基因組學(xué)中心監(jiān)管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使來(lái)自初始基因敲除過(guò)程的受精卵中的干擾基因發(fā)生突變。“我們獲得了受精卵，將CRISPR-Cas9注射進(jìn)去。8周后，Hui便獲得了雙突變體。”Nutter介紹說(shuō)，“如果利用胚胎干細(xì)胞，可能需要好幾年才能完成。”

這場(chǎng)革命不只限于培育擁有生殖細(xì)胞系突變的小鼠。CRISPR還允許研究人員同時(shí)使若干疑似癌癥基因在成年小鼠體細(xì)胞中發(fā)生突變。與此同時(shí)，CRISPR敲入可修正成年小鼠體內(nèi)引發(fā)疾病的基因缺陷，比如導(dǎo)致血友病和鐮狀細(xì)胞性貧血的突變。若干研究小組計(jì)劃將CRISPR注射進(jìn)正在發(fā)育的小鼠體內(nèi)，目標(biāo)則是創(chuàng)建可發(fā)揮條形碼作用的突變并且使科學(xué)家得以追蹤細(xì)胞分化時(shí)的細(xì)胞譜系。

諸如多倫多表型基因組學(xué)中心、JAX等小鼠培育公司希望，CRISPR將極大地?cái)U(kuò)展它們產(chǎn)生的突變范圍。“現(xiàn)在，我可以獲得擁有3處基因改造的異乎尋常的小鼠，并能再次改造它。”Wiles介紹說(shuō)，“我們無(wú)法利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的基因改造。我們可以將一只擁有兩處基因改造的小鼠同另一只擁有兩處基因改造的小鼠雜交，但獲得全部4處基因改造需要數(shù)年時(shí)間。”

任重而道遠(yuǎn)

不過(guò)，從某個(gè)方面來(lái)說(shuō)，CRISPR革命步履蹣跚。在Jaenisch實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)告CRISPR的3個(gè)月后，他和同事在發(fā)表于《細(xì)胞》雜志的第二篇論文中提出，CRISPR可輕易實(shí)施更加復(fù)雜的基因手術(shù)，即敲入DNA片段而非簡(jiǎn)單地令基因喪失功能。作為示范，他們利用CRISPR將熒光標(biāo)記敲入小鼠受精卵。當(dāng)特定基因被開(kāi)啟時(shí)，熒光標(biāo)記便會(huì)亮起。研究人員還創(chuàng)建了對(duì)很多研究來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的條件突變體。

約1/3的小鼠基因?qū)τ谂咛グl(fā)育是必不可少的。如果這些基因從一開(kāi)始就喪失功能，小鼠便不會(huì)誕生。因此，利用胚胎干細(xì)胞開(kāi)展研究的科學(xué)家巧妙地設(shè)計(jì)出一種被稱為Cre-Lox 重組的系統(tǒng)。該系統(tǒng)僅在小鼠發(fā)育到足以在失去上述基因仍能存活下來(lái)后才會(huì)將基因敲除。這需要添加額外的DNA：位于靶基因兩側(cè)的Lox序列和一個(gè)Cre基因。其中，Cre基因可被啟動(dòng)，以產(chǎn)生一種酶，用于修改Lox位點(diǎn)之間的DNA。Jaenisch團(tuán)隊(duì)利用CRISPR將同一系統(tǒng)插入受精卵，并且報(bào)告稱以相對(duì)較高的效率培育出條件小鼠——約16%的受精卵產(chǎn)生了擁有正確突變的小鼠幼崽。

雖然在英國(guó)惠康基金會(huì)桑格研究所領(lǐng)導(dǎo)一個(gè)團(tuán)隊(duì)培育突變小鼠胚胎干細(xì)胞的William Skarnes是為Jaenisch的最初報(bào)告所折服的眾多研究人員之一，但當(dāng)他試圖將該技術(shù)帶入自己的實(shí)驗(yàn)室時(shí)卻感到了失望。“從他的論文看，這項(xiàng)技術(shù)很簡(jiǎn)單。我非常有信心，它將淘汰掉胚胎干細(xì)胞。”Skarnes表示，“但令人失望的是，我們沒(méi)有人能重現(xiàn)Jaenisch所報(bào)告的效率。在JAX實(shí)驗(yàn)室，產(chǎn)生擁有正確突變的小鼠幼崽的受精卵僅占1%或2%。同時(shí)，很多項(xiàng)目正走向失敗。很明顯，它并未被證實(shí)為一種穩(wěn)健的方法。”

無(wú)論目前CRISPR看上去有何種缺點(diǎn)，Wiles強(qiáng)調(diào)說(shuō)，它在改造小鼠方面的潛力不應(yīng)當(dāng)被忽視。“CRISPR能做的事情有很多，而我們才剛剛開(kāi)始入門。”