Fluorospark(R) 激酶/ADP 多重檢測試劑盒（291-77401）

來源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2020-09-02 15:50:00【大中小】

Fluorospark^® Kinase/ADP Multi-Assay Kit是和光(wako)與日本東京大學(xué)新藥研究機(jī)構(gòu)共同研發(fā)的ADP熒光檢測試劑盒。擁有高通量篩選（HTS）必備的高靈敏度、高準(zhǔn)確度、低成本、簡便等特性。本產(chǎn)品不僅可檢測激酶，同時(shí)可用于檢測產(chǎn)生ADP的酶（如ATP酶、乙?；?mdash;CoA羧化酶）的活性。咨詢訂購熱線：400-021-8158

激酶分析篩選試劑盒
Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒(貨號291-77401)
Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

Fluorospark(R) 激酶/ADP多重檢測試劑盒(#291-77401)

Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒

簡單快捷，高靈敏度定量檢測ADP。用紅色熒光“Resorufin”定量經(jīng)激酶反應(yīng)生成的ADP，可實(shí)時(shí)檢測。

激酶抑制劑的篩選
激酶活性測定
ADP產(chǎn)生酶活性分析

試劑盒原理

本試劑盒通過酶偶聯(lián)反應(yīng)，簡單、高靈敏度地定量檢測ADP。經(jīng)激酶反應(yīng)生成的ADP，可用紅色熒光物質(zhì)試鹵靈定量。

Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒檢測原理

優(yōu)點(diǎn)/特點(diǎn)

● 適合終點(diǎn)(endpoint)和實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)
● 優(yōu)異的Z'-factor數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)差異小）
● 高靈敏度檢測ADP量
● 檢測直到ADP 30 μmol/L仍可保持線性關(guān)系
● 一步反應(yīng)，檢測時(shí)間短（~30分鐘）
● 成本較低

與傳統(tǒng)發(fā)光法比較

試劑名稱	Fluorospark^® Kinase	傳統(tǒng)發(fā)光法（A公司）
原理	ADP定量（熒光）（直接定量生成的ADP）	ADP定量（發(fā)光）（需要把生成的ADP變換成ATP再定量）
操作順序	1步	2步
所需時(shí)間	30分鐘	70~100分鐘
ADP定量范圍	~30 μmol/L	~1 mmol/L
價(jià)格	低成本

試劑盒組成

No. 試劑	用途	1,000次	10,000次
底物液	2×制備檢測液	9 mL	90 mL
酶液		500 μL	5 mL
刃天青液		100 μL	1 mL
還原封閉劑		400 μL	4 mL
D　終止液	停止偶聯(lián)反應(yīng)	10 mL	100 mL
10 mmol/L ATP溶液	激酶反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線	100 μL	1 mL
10 mmol/L ADP溶液	制作標(biāo)準(zhǔn)曲線	100 μL	1 mL

案列應(yīng)用

【實(shí)驗(yàn)流程（終點(diǎn)（endpoint）法）】

激酶反應(yīng)液里添加等量的2×檢測液（使用時(shí)制備）即可檢測激酶活性

【制作ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線】

用0、10、20、30 μmol/L ADP制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

良好的線性關(guān)系可定量最多至30 μmol/L的ADP。

【低濃度ADP區(qū)域里定量】

制作各ATP/ADP濃度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L）里底物變換率0-10%標(biāo)準(zhǔn)曲線

ATP/ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線里底物變換率低（=ADP濃度低）時(shí)線性關(guān)系依然較好

【熒光信號的穩(wěn)定性】

20 μmol/L ADP和2x檢測液混合，在30分鐘~7小時(shí)候檢測熒光強(qiáng)度。30分鐘后的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為100%，相關(guān)變動(dòng)表格如下。

ADP和2×檢測液混合后，在30分~7小時(shí)內(nèi)的熒光信號十分穩(wěn)定。

【數(shù)據(jù)：Z'-factor實(shí)測值】

定量與各ATP/ADP濃度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L），5%底物變換率相當(dāng)?shù)腁DP時(shí)，本試劑盒方法與傳統(tǒng)發(fā)光法的Z'-factor比較。

Z'-factor：Fluorospark® Kinase >傳統(tǒng)發(fā)光法（A公司）
在各ATP濃度里，5%低底物變換率也有優(yōu)異的Z'-factor。

【什么是Z'-facotr】

Z'-facotr是一個(gè)關(guān)于信號區(qū)間和變異的組合，它已成為評估測試方法質(zhì)量的主要參數(shù)。使用Z'-factor=1-(3×SDH+3×SDL)/(AvH-AvL)公式計(jì)算（SDH和SDL為陽性對照和陰性對照的方差，AVH和AVL為陽性對照和陰性對照的平均值）。

Z-factor	Interpretation
1.0	理想情況下等于1.0。Z factor永遠(yuǎn)不可能超過1.0。
0.5-1.0之間	較好的實(shí)驗(yàn)。
0-0.5之間	臨界的實(shí)驗(yàn)（較差的實(shí)驗(yàn)）。
小于0	陽性對照和陰性對照的數(shù)值有很多重疊。

【制作抑制曲線】

制作cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)抑制劑H-89的抑制曲線（PKA 0.02U/μL，ATP 5μmol/L，Kemptide 125μg/mL及各濃度的H-89）

Fluorospark® Kinase與傳統(tǒng)發(fā)光法（A公司）有幾乎相同的IC50值。
（本方法得到的H-89 IC50值與文獻(xiàn)值*（IC50=40nmol/L）幾乎相同）
* Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).

【實(shí)驗(yàn)流程（實(shí)時(shí)法）】

通過實(shí)時(shí)檢測熒光強(qiáng)度，實(shí)時(shí)檢測激酶活性。

【ADP定量反應(yīng)時(shí)間的比較（實(shí)時(shí)檢測）】

對各濃度ADP［ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）］進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。

Fluorospark® Kinase在約十分鐘內(nèi)完成ADP定量反應(yīng)。背景（ADP=0 μmol/L）信號穩(wěn)定。

【實(shí)時(shí)檢測添加DTT的影響】

ADP=2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）里添加還原劑DTT（0.1、1 mmol/L），進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。

Fluorospark® Kinase在約十分鐘內(nèi)完成ADP定量反應(yīng)。即使DTT濃度增高，結(jié)果依然穩(wěn)定。

【通過實(shí)時(shí)檢測計(jì)算PKA的Km（ATP）值】

在各種ATP濃度下通過實(shí)時(shí)檢測計(jì)算出PKA反應(yīng)速度，并求取ATP的PKA（Km值）

根據(jù)實(shí)時(shí)檢測進(jìn)行酶的動(dòng)力學(xué)分析。
本方法得到的Km值與文獻(xiàn)值**（3~15 μmol/L）幾乎相同）
** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).

產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	級別
291-77401	Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit Fluorospark® 激酶/ADP 多重檢測試劑盒	1000次	for Enzyme Activity Assay