島津蛋白測序儀專用試劑/色譜柱

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2020-03-11 10:52:00【大中小】

島津公司的蛋白質測序儀（Protein Sequencer）PPSQ以Edman降解法為基礎，將蛋白質從N-末端順次切斷進行序列分析。此方法具有直接測定、可靠性高的優(yōu)勢。PPSQ 51A/53A開發(fā)了單克隆抗體藥、重組蛋白藥的N-末端氨基酸序列分析方法，另外，也開發(fā)了具有特殊結構的生物藥N-末端氨基酸序列分析方法。

N-末端氨基酸序列分析是很多已上市生物藥的年檢項目，并在開發(fā)和質量控制方面起著至關重要的角色。高靈敏度、適用于基因克隆探針引物常規(guī)氨基酸序列測定的蛋白序列儀的市場占有量日益擴大，島津與Fujifilm-Wako聯(lián)合開發(fā)的儀器配套試劑/色譜柱可助力蛋白組學研究。

西寶生物作為Wako指定國內代理商,提供島津蛋白測序儀PPSQ配套用wako品牌試劑和耗材，進口品質，產(chǎn)品齊全，貨期穩(wěn)定。

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埃德曼降解法

埃德曼降解法（Edman degradation method）是由菲爾•埃德曼（Pehr Edman）首先創(chuàng)立，用于肽鏈或蛋白質N-末端氨基酸序列分析的常用方法，其原理很簡單，在堿性條件下反應，用異硫氰酸苯酯（Phenyl isothiocyanate, PITC）與待檢測的蛋白質（多肽）的N-末端氨基生成苯氨基硫甲酰（PTC）的衍生物，然后處理-關環(huán)-選擇性切斷肽鏈N-端，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機溶劑萃取衍生物，在酸的作用下，不穩(wěn)定的生物轉變?yōu)榉€(wěn)定的的乙內苯酰硫脲（PTH）衍生物，余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的乙內酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），可以鑒定出氨基酸類別。重復氨基酸鑒定反應以達到對N端氨基酸按照從N端到C端的方向依次對氨基酸序列進行分析。對于序列較長的蛋白質（多肽），還可以將樣品先切成小的肽段，先對肽段序列分析，再將肽段信息進行拼接即可獲得完整蛋白質的序列信息。

背景

島津公司的蛋白質測序儀（Protein Sequencer）PPSQ以Edman降解法為基礎，將蛋白質從N-末端順次切斷進行序列分析。此方法具有直接測定、可靠性高的優(yōu)勢。近期，島津推出新型的蛋白質測序儀PPSQ 51A/53，配備SPD-M30A高靈敏度檢測器、軟件滿足FDA 21 CFR Part 11數(shù)據(jù)完整性的要求。PPSQ 51A/53梯度系統(tǒng)更是在等度系統(tǒng)基礎上，提高檢測靈敏度，適合微量樣品的氨基酸序列分析。應用島津PPSQ 51A/53A開發(fā)了單克隆抗體藥、重組蛋白藥的N-末端氨基酸序列分析方法，另外，也開發(fā)了具有特殊結構的生物藥N-末端氨基酸序列分析方法，如甲硫氨酸缺失、焦谷氨酸環(huán)化封閉等樣品。

目前，在制藥領域，生物藥得到越來越多的關注。生物藥是利用DNA重組、細胞融合、細胞培養(yǎng)等生物技術開發(fā)出的蛋白質藥物、抗體藥物等。幾乎所有蛋白質合成都起始于N-末端，其序列組成對于蛋白質整體的生物學功能有著重要的影響力，因此蛋白質的序列分析對于生物藥效果很關鍵。不僅在研發(fā)中，而且在質量控制中都很重要。

2015版《中國藥典》三部人用重組DNA技術產(chǎn)品總論對生物藥的生產(chǎn)及質量控制方面，，針對其蛋白質結構提出技術要求，應測定目標產(chǎn)品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進行比較。因此，N-末端氨基酸序列分析是很多已上市生物藥的年檢項目，如重組人促紅素注射液（CHO細胞）、重組人粒細胞刺激因子注射液等。此外，國際法規(guī)中也有對于生物藥N-末端氨基酸序列測定的要求。藥品注冊的國際協(xié)調組織頒布的指導法規(guī)ICH-Q6B規(guī)定，生物藥進行申報時，必須提供N-末端氨基酸序列信息。《歐洲藥典》中規(guī)定，生物仿制藥申報也必須提供N-末端序列信息。

PTH氨基酸的梯度分離案列

在PPSQ系統(tǒng)（Edman降解法）分析柱中加入50ul的樣本溶液，為了進行梯度洗脫而不改變該點，使用了一個半微柱。流動相A為乙酸鹽緩沖液、乙腈，流動相B為乙酸鹽緩沖液、甲醇、2-丙醇。

圖4（a）表示通過梯度洗脫2pmol的PTH-氨基酸標準混合物而獲得的色譜圖

圖4（b）表示通過等度洗脫而獲得的色譜圖。

盡管PTH氨基酸的洗脫順序略有不同，但檢測到通過梯度洗脫獲得的PTH氨基酸的峰高比等度洗脫高約3至5倍。

蛋白質測序儀比較一個循環(huán)和上一個循環(huán)之間PTH氨基酸峰的增加和減少，并鑒定出特異性檢測的PTH氨基酸。

圖1 PTH-氨基酸標準混合物（2 pmol）的分析
（A）梯度系統(tǒng)，（b）等度系統(tǒng)

在等度洗脫中，由于流動相的組成恒定，因此洗脫時間較晚的疏水性氨基酸的峰高較低。另一方面，梯度洗脫可改善高疏水性PTH氨基酸的分離，因為具有高洗脫能力的流動相B的濃度會隨時間增加（圖1a）。

梯度洗脫還可以分離和檢測500 fmol的PTH氨基酸（圖2），即使使用蛋白質測序儀分析小樣品，也可以輕松檢測特異增加的PTH氨基酸。

圖2 分析PTH-氨基酸標準混合物（500 fmol）

Wako品牌蛋白測序儀配套用試劑/色譜柱

蛋白內切酶

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	中文名稱	包裝	用途
125-05061	Lysyl Endopeptidase, Mass Spectrometry Grade	賴氨酰肽鏈內切酶，質譜等級	20 ug×5	用于蛋白質研究
202-15951	Trypsin, from Porcine Pancreas, Mass Spectrometry Grade	胰蛋白酶，從豬胰臟中，質譜等級	20 μg×5	用于蛋白質研究
050-05941	Endoproteinase Glu-C, Sequencing Grade	測序級谷氨酰蛋白內切酶Glu-C	50ug	用于蛋白質研究
056-05921	Endoproteinase Asp-N, Sequencing Grade	測序級天冬氨酰蛋白內切酶Asp-N	2ug	用于蛋白質研究

色譜柱

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	中文名稱	包裝	用途
235-63951	WakopakWakosil-PTH-II 4.6×250mm(S-PSQ)	氨基酸硅膠柱PTH-II色譜柱	1 Column	專用柱

試劑耗材

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	中文名稱	包裝	用途
200-20021	12% Trimethylamine Solution	12%三甲胺溶液【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
207-10761
207-20031	Trifluoroacetic Acid	三氟乙酸【危】	40 mL	用于島津蛋白肽測序
204-10771
018-26041	37% Acetonitrile Solution	37%的乙腈溶液【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
014-13831
033-24371	1-Chlorobutane	1-氯丁烷【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
021-09851
052-09041	Ethyl Acetate	乙酸乙酯【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
054-04981
084-05501	Heptane	庚烷【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
014-12471	Acetonitrile	乙腈【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
165-27361	PTH-amino Acids Mixture Standard	PTH-氨基酸混合標準品【危】	2 mL用×4	用于島津蛋白肽測序
163-12271
168-27351	PTH-amino Acids Mobile Phase	PTH-氨基酸流動相【危】	1 L	用于島津蛋白肽測序
161-14271
161-27341	5% Phenyl Isothiocyanate, n-Heptane Solution	5%異硫氰酸苯酯，正庚烷溶液【危】	40 mL	用于島津蛋白肽測序
168-14161
204-20041	25% Trifluoroacetic Acid Solution	25%三氟乙酸溶液【危】	40 mL	用于島津蛋白肽測序
203-12201
072-06461	Glass Fiber Disk, TFA Treated	玻璃纖維盤，TFA處理	50 Plates	用于島津蛋白肽測序
073-04171
132-18821	30%N-Methylpiperidine Solution(for Gradient Elution)	30% N-甲基哌啶溶液（用于梯度洗脫）【危】	200 mL	用于島津蛋白肽測序
202-20721	25% Trifluoroacetic Acid Solution (for Gradient Elution)	25% 三氟乙酸溶液（用于梯度洗脫）【危】	40 mL	用于島津蛋白肽測序
236-63981	Wakopak^® Wakosil PTH-GR (S-PSQ)(for Gradient Elution)	Wakopak^®Wakosil PTH-GR (S-PSQ)（用于梯度洗脫）	1 EA	用于島津蛋白肽測序
163-28261	PTH-amino Acids Mobile Phase A (for Gradient Elution)	PTH-氨基酸流動相 A（用于梯度洗脫）【危】	1 L	用于島津蛋白肽測序
160-28271	PTH-amino Acids Mobile Phase B (for Gradient Elution)	PTH-氨基酸流動相 B（用于梯度洗脫）【危】	1 L	用于島津蛋白肽測序

染色

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	中文名稱	包裝	用途
293-57701	Negative Gel Stain MS Kit	負凝膠染色MS試劑盒	20 tests	用于電泳
299-58901	Silver Stain MS Kit	銀染劑MS試劑盒	20 tests	用于電泳