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蛋白磷酸化研究的預制膠 SuperSep Phos-tag(TM)

來源：作者：人氣：-發表時間：2025-04-29 14:31:00【大中小】

蛋白磷酸化研究的預制膠

SuperSep Phos-tag™

SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法，無需特異性磷酸化抗體或者同位素標記。

◆SuperSep Phos-tag™

Phos-tag™ 是一種預制膠，預先加入了 50 μmol/L 的 Phostag™ Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩定性很好，得到的帶條結果也很整齊。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。

分離后，膠可用于考馬斯亮藍染色，免疫印跡和質譜實驗。

◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理

◆在 HighWire Search 上搜索到的論文數

◆運用

利用 p35 的丙氨酸突變體確定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位點

p35 常見的磷酸化位點是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位點往往會發生丙氨酸突變，產生３種突變體（Ser8 突變體：S8A，Thr138 突變體：T138A，Ser8 和 Thr138 雙突變體：2A）。這３種突變體、野生型 p35、Cdk5 和沒有激酶活性的 Cdk5 都來源于 COS-7 細胞。這些細胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE 和 Western blotting 進行檢測（檢測抗體：p35 抗體）。

100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠

- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道５（條帶 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下發生了磷酸化；

- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道３（條帶 L2 和 L4）：在無激酶活性 Cdk5 的作用下，大約有一半 p35 蛋白在 Thr138 位點發生磷酸化，同樣在 138 位發生突變的 p35 蛋白亦是如此。

- 泳道５（條帶 M1）和泳道６（條帶 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位點；

- 泳道５（條帶 M1）、泳道７（條帶L1和L2）和泳道８（條帶M2）：條帶 M1 是 Ser8 和T hr138 都發生磷酸化的條帶；

條帶 M2 是只有 Ser8 磷酸化的條帶；條帶 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的條帶。

※ 條帶 L1 和 L3 中的Ｘ是不確定哪個位點發生磷酸化的條帶；

※ 條帶L4是非磷酸化的 p35 。

可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關系！

【參考文獻】

? Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

【結果提供】

理化學研究所腦科學綜合研究中心回路功能研究核心記憶功能研究團隊細川智永（Dr. T. Hosokawa）

首都大學東京理工學研究科生命科學專業神經分子功能研究室久永真市（Dr. S. Hisanaga）

檢測含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段

① 采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化 GST-Dnmt1（1-290）結合蛋白

② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1（1-290）作為體外激酶實驗的反應底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，確定遷移條帶中每個片段的激酶活性

可確定在片段中含有目的激酶！

【參考文獻】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.

【結果提供】

高知大學綜合研究中心生命、功能物質部門實驗實習機器設施杉山康憲（Dr. Y. Sugiyama）

香川大學農學部應用生物科學科動物功能生化學研究室龜下勇（Dr. I. Kameshita）

二維電泳中的應用：分析 hnRNP K 磷酸化異構體

小鼠巨噬細胞 J774.1 經 LPS 刺激后，裂解細胞，經過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K。在二維電泳中，一維是 IPG 膠，二維是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構體。利用質譜儀，可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。

同一個等電點的位置上，不同位點發生磷酸化都可以被區分開來

（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【參考文獻】

? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【結果提供】

橫濱市立大學生命納米系統科學研究科生物體超分子系統科學專業木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）

理化學研究所 RCAI 小原收

◆備注

樣品制備：

Phos-tag SDS-PAGE 對于蛋白樣品中的雜質非常敏感，尤其是螯合劑，釩酸，無機鹽，表面活性劑這類物質。

強烈建議在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通過 TCA 沉淀或滲析法降低雜質含量。

轉膜前處理：

另一個必須的步驟是在轉膜前，用 EDTA 去除凝膠中的金屬離子（Mn²⁺或者Zn²⁺）；該步驟可提高蛋白的轉膜效率。

●　分別準備 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 兩種 1x transfer buffer。

●　將凝膠浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分鐘，溫和搖晃。更換新緩沖液，重復３次。

●　將凝膠浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分鐘，溫和搖晃。

●　轉膜操作*。

* 建議用濕法轉膜，以提高轉膜效率。

◆質量控制

每一批 SuperSep Phos-tag™，出廠前均根據其產品規格進行測試，以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他們的分離成都在正常參數內。

◆保存溫度

2-10℃

產品列表

用于 Wako EasySeparator 電泳儀

產品編號	產品名稱	產品規格
193-16711	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13 well Phos-tag 13孔10%預制膠	5塊
190-16721	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 17 well Phos-tag 17孔10%預制膠	5塊
195-16391	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 13 well Phos-tag 13孔12.5%預制膠	5塊
193-16571	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 17 well Phos-tag 17孔12.5%預制膠	5塊
193-16691	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13 well Phos-tag 13孔15%預制膠	5塊
196-16701	SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well Phos-tag 17孔15%預制膠	5塊
192-17381	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 7.5%, 17well Phos-tag™ 預制膠50μmol/l，7.5%，17孔	5塊
195-17371	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 7.5%, 13well Phos-tag™ 預制膠50μmol/l，7.5%，13孔	5塊
199-17391	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 6%, 17well Phos-tag™ 預制膠50μmol/l，6%，17孔	5塊
192-17401	SuperSepTM Phos-tagTM (50μmol/L), 6%, 13well Phos-tag™ 預制膠50μmol/l，6%，13孔	5塊

用于 Bio-Rad 伯樂電泳儀

產品編號	產品名稱	產品規格
198-17981	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm	5 塊
195-17991	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm	5 塊

用于 Life Technologies 電泳儀

產品編號	產品名稱	產品規格
192-18001	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm	5 塊
199-18011	SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm	5 塊