活細胞內蛋白質編輯：內源性蛋白非經典殘基整合新途徑

來源：作者：人氣：-發表時間：2025-05-07 12:37:00【大中小】

摘要：研究人員開展了細胞內蛋白質編輯技術的研究。

在哺乳動物細胞中原位研究蛋白質，對于深入理解真核細胞生物學至關重要。為了在活的哺乳動物細胞中研究蛋白質，通常需要給目標蛋白添加氨基酸（從相對較小的肽到較大的融合蛋白不等）作為實驗 “抓手”，以此在整個實驗過程中追蹤或控制目標蛋白。這些標簽雖然給細胞內蛋白質研究帶來了變革，但也存在局限性：它們可能影響目標蛋白的特性，并且在研究動態過程時大多缺乏時間分辨率。化學標簽因其體積小、種類多樣（超出了基因編碼的氨基酸范圍）而具有優勢，然而將其應用于哺乳動物細胞中的蛋白質卻困難重重。顯然，在活的哺乳動物細胞中標記和操縱蛋白質，需要新技術的支持。

受化學生物學和基因編輯領域最新進展的啟發，研究人員設想出一種能夠在哺乳動物細胞內對蛋白質一級序列進行翻譯后編輯的技術，這種技術還能作用于最能代表天然生物學狀態的內源性蛋白質。該系統能夠在用戶指定的位點，將外源蛋白質片段拼接到目標蛋白中，實現時間上的精準控制，還能引入有用的標記和非經典氨基酸（noncanonical amino acids，ncAAs）。為實現這一目標，研究人員設計了一種細胞內蛋白質編輯系統，該系統依賴兩對分裂內含肽（split intein）蛋白，這些蛋白可以分別連接多肽鏈。串聯使用時，這些分裂內含肽能夠將供體肽編輯到目標蛋白內部的受體位點。受體序列可以通過基因組編輯插入內源性蛋白，也可以插入外源表達的蛋白中。相應的供體蛋白通過重組產生，這樣一來，如果有需要，就能大規模整合非經典氨基酸并進行化學標記。將供體蛋白導入活的哺乳動物細胞后，就能快速把供體編輯到目標蛋白中。

圖1 細胞內蛋白質編輯能夠在內源性蛋白質中引入非經典氨基酸殘基

研究人員首先展示了一種通用的編輯方法，即將含有抗原決定簇標簽的通用最小供體，編輯到模型蛋白鈣連蛋白（calnexin）和 β - 肌動蛋白（β -actin）中。通過免疫印跡、熒光顯微鏡和基于質譜的蛋白質組學技術，他們證實了蛋白質一級序列發生了編輯。時間特性分析顯示，在供體蛋白導入 10 分鐘內就會發生編輯，這使得在生物學相關的時間尺度上開展實驗成為可能。研究人員還展示了一種序列特異性編輯模式，轉錄因子 c - Myc 和激酶 Chk1 幾乎無痕地被編輯，從而能夠對這些動態蛋白質進行時間分辨研究。此外，利用蛋白質組學和轉錄組學方法，研究人員發現 Chk1 和 c - Myc 在編輯后仍然保持功能，這證明了該蛋白質編輯技術近乎無痕且干擾極小。

此外，研究人員在大腸桿菌（Escherichia coli）中利用基因編碼擴展技術，將非經典氨基酸和點擊化學手柄對疊氮基苯丙氨酸（p-azido-phenylalanine，pAzF）編碼到供體蛋白中，然后再用小分子進行標記。之后，他們將小分子熒光團或生物素編輯到內源性鈣連蛋白中，實現了對內源性蛋白質的顯微鏡觀察和下拉實驗，而且無需使用抗體。

圖2 細胞內蛋白質編輯

這項研究建立了一種在活的哺乳動物細胞中編輯蛋白質一級氨基酸序列的方法。該方法能夠在目標蛋白（包括內源性蛋白）中，實現非經典氨基酸和有用標記的位點特異性編輯。最終，該技術能夠以無干擾且具有時間分辨率的方式標記和操縱蛋白質。這種蛋白質編輯方法是研究哺乳動物細胞中蛋白質的技術寶庫中一項實用且應用廣泛的新成員，有望在各種應用場景中，對幾乎無窮無盡的目標蛋白進行編輯、操縱和觀察。

參考資料

[1] Intracellular protein editing enables incorporation of noncanonical residues in endogenous proteins