LudgerTag DMB唾液酸釋放和標(biāo)記試劑盒
貨號(hào)：LT-KDMB-A1
包裝：1 Reaction Set
包裝：1 Reaction Set
- 英文名：DMB Sialic Acid Labeling Kit
- 別名：唾液酸釋放標(biāo)記試劑盒
- 品牌：Ludger
LudgerTag DMB唾液酸釋放和標(biāo)記試劑盒（貨號(hào)：LT-KDMB-A1）和包含試劑，用于從糖蛋白釋放唾液酸，通過(guò)胺環(huán)化反應(yīng)釋放的唾液酸阿和DMB結(jié)合。用于從糖蛋白釋放唾液酸，再用1，2-二氨基-4，5-亞甲氧基苯二鹽酸鹽（DMB）標(biāo)記。
*西寶提示：我司所銷(xiāo)售的化學(xué)試劑、原料等所有產(chǎn)品（包括但不限于抗生素類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、試劑盒類(lèi)產(chǎn)品等）僅限用于科學(xué)研究用途，不得作用于人體。
訂購(gòu)熱線：400-021-8158
LudgerTag DMB唾液酸釋放和標(biāo)記試劑盒（貨號(hào)：LT-KDMB-A1）和包含試劑，用于從糖蛋白釋放唾液酸，通過(guò)胺環(huán)化反應(yīng)釋放的唾液酸阿和DMB結(jié)合。
應(yīng)用：用于從糖蛋白釋放唾液酸，再用1，2-二氨基-4，5-亞甲氧基苯二鹽酸鹽（DMB）標(biāo)記。
相對(duì)分子量 = 225.07 gmol-1
熒光 λex = 373 nm, λem = 448 nm.
結(jié)構(gòu)
近義詞 DMB; 1,2-Diamino-4,5-methylenedioxybenzene Dihydrochloride; 1,3-Benzodioxole-5,6-diamine Dihydrochloride; 5,6-Diamino-1,3-benzodioxole Dihydrochloride
描述：該試劑盒和包含試劑，用于從糖蛋白釋放唾液酸，通過(guò)胺環(huán)化反應(yīng)，經(jīng)釋放的唾液酸和DMB結(jié)合。
樣品測(cè)試數(shù)：本試劑盒包含試劑和原料，可供不超過(guò)22個(gè)樣品檢測(cè)用，包括唾液酸參照品、N-乙酰基神經(jīng)氨酸和N-乙二醇神經(jīng)氨酸定量標(biāo)準(zhǔn)品。
樣品量：通常每次可以分析50-200μg糖蛋白。我們建議分析樣品一式三份。
適合測(cè)試樣品：從糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的唾液酸都可以標(biāo)記。
儲(chǔ)存： 保存在 -18°C暗處。避免熱源，光照和潮濕。如妥善保存，試劑可以穩(wěn)定至少2年。
運(yùn)輸：該產(chǎn)品可以在室溫下運(yùn)輸。
處置： 使用時(shí)涉及的玻璃或塑料器皿以及溶劑，應(yīng)確保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有樣品處理時(shí)，使用無(wú)粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。打開(kāi)試劑瓶后，應(yīng)立即使用。多余試劑根據(jù)當(dāng)?shù)匾?guī)則丟棄。
說(shuō)明：僅供研究用。不得用于人體或藥用。請(qǐng)閱讀SDS數(shù)據(jù)表了解所涉及的化學(xué)品。進(jìn)行標(biāo)記試劑涉及的每個(gè)操作，都應(yīng)使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人保護(hù)裝置 - 眼鏡、耐化學(xué)性手套（如 腈類(lèi)手套），以及在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)柜進(jìn)行操作。
試劑盒組成
每個(gè)試劑盒包括以下試劑各1瓶：
| Cat. | # Item | Quantity |
| LT-DMB-01 | DMB染料 | 0.7 mg |
| LT-ACETIC2M-01 | 冰醋酸 2 Molar | 2 x 1.1 mL |
| LT-MERCAPTO-01 | 巰基乙醇醋酸溶液 (1.4 Molar) | 500 μL |
| LT-DITHIO-01 | 連二亞硫酸鈉 (Reductant) | 4 mg |
| CM-NEUAC-01 | N-乙酰基神經(jīng)氨酸定量標(biāo)準(zhǔn)品 | 1 nmol |
| CM-NEUGC-01 | N-乙二醇基神經(jīng)氨酸定量標(biāo)準(zhǔn)品 | 1 nmol |
| CM–SRP-01 | 唾液酸參照品，包括 Neu5Ac, Neu5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5Gc, 9Ac, Neu5, 8Ac2, Neu5,9Ac2 and Neu5,x,xAc3 (此處x表示未知乙?；恢? | 1.25 nmol (總唾液酸) |
所需的其他試劑和設(shè)備
- 加熱模塊、爐或相近功能的干熱器，設(shè)定在80°C用于唾液酸釋放，設(shè)定在50°C用于唾液酸標(biāo)記反應(yīng)
- 量程在1-1000 µL的移液器和吸頭
- 真空離心機(jī)
- 反應(yīng)小瓶 (e.g. 0.5 mL聚丙烯瓶)
- 分析級(jí)水 (eg. MilliQ)
- 如需重復(fù)檢測(cè)，額外的唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品【可選】：CM-NEUAC-01; CM-NEUGC-01
-
陽(yáng)性對(duì)照【推薦】：
標(biāo)記操作的時(shí)間線
LudgerTag™ 標(biāo)記過(guò)程, 加上干燥時(shí)間和從分析樣品中酸解唾液酸，通常需要7個(gè)小時(shí)：
| 過(guò)程 | 時(shí)間 |
| 樣品制備 | 20分鐘 + 干燥 (1-2 小時(shí)) *該操作可提前1天進(jìn)行 |
| 唾液酸釋放 | 3 小時(shí) |
| DMB 標(biāo)記 | 3.5 小時(shí) |
| 總時(shí)間： | 加上干燥7小時(shí) |
方法
1 樣品制備
• 我們建議使用三等份試樣進(jìn)行分析。高度唾液酸化的糖蛋白，取樣量50μg為宜；對(duì)于低唾液酸化樣品，如IgG等，取樣量提高至200μg。
• 請(qǐng)注意部分蛋白質(zhì)常用的鹽/緩沖液可能對(duì)唾液酸分析產(chǎn)生干擾。這取決于樣品取樣量與緩沖液體積的比例(大量緩沖液會(huì)影響酸性水解時(shí)溶液的酸性)。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，類(lèi)似PBS等緩沖液，在樣品濃度高于1mg/mL,樣品取樣量在50-200 µg 之間，不會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。
• 我們建議在樣品分析過(guò)程時(shí)，使用一系列的控制標(biāo)品：
陽(yáng)性過(guò)程控制糖蛋白：胎球糖蛋白: GCP-FET-50U
陽(yáng)性過(guò)程定量控制糖肽: BQ-GPEP-A2G2S2-10U
陰性過(guò)程控制標(biāo)品: 水
陰性過(guò)程控制標(biāo)品: 樣品緩沖液
陽(yáng)性過(guò)程定量控制糖肽: BQ-GPEP-A2G2S2-10U
陰性過(guò)程控制標(biāo)品: 水
陰性過(guò)程控制標(biāo)品: 樣品緩沖液
• 將等量的樣品和過(guò)程控制標(biāo)品（除非已經(jīng)干燥）置于0.5 mL聚丙烯小瓶中, 在真空離心機(jī)中干燥。
2 唾液酸釋放
• 設(shè)定爐溫80°C
• 往樣品和過(guò)程控制樣小品中加入25 µL 2 M冰醋酸溶液。
以下唾液酸標(biāo)樣中不要加: 如使用Neu5Ac (CM-NEUAC-01), Neu5Gc (CM-NEUGC-01), Sialic acid 參照品 (CM-SRP-01) 小瓶 或 Neu5,9Ac2 (CM-NEU5,9,AC-01)。
• 旋渦溶解，然后短暫離心。
• 將樣品和對(duì)照品置于80°C的烘箱中，培養(yǎng)2小時(shí)（±5分鐘）。從烤箱中取出，冷卻至室溫。旋渦，然后短暫的離心。
• 從每個(gè)樣品或過(guò)程控制轉(zhuǎn)移5微升到0.5毫升的聚丙烯小瓶中，準(zhǔn)備用DMB標(biāo)記。如需要，經(jīng)酸釋放的樣品可在-20°C下儲(chǔ)存至少2天[參考1]。
3 DMB標(biāo)記
• 設(shè)定爐溫50°C.
• 添加440 μL巰基乙醇溶液（LT-MERCAPTO-01）到盛有連二亞硫酸鈉（LT-DITHIO-01）的小瓶中，使用移液器反復(fù)抽吸混合直至固體溶解。
• 將上述溶液轉(zhuǎn)移到盛有DMB 染料 （LT-DMB-01）的小瓶中，使用移液器反復(fù)抽吸混合直至染料溶解。
為保護(hù)標(biāo)記試劑不受濕氣和曝光的影響，應(yīng)在60分鐘內(nèi)使用。 • 將20 μL標(biāo)記試劑加入每個(gè)樣品和過(guò)程控制樣中，蓋蓋，渦旋徹底混合并短暫離心，確保標(biāo)記溶液位于瓶底部。
• 將20 μL標(biāo)記試劑加入每個(gè)唾液酸標(biāo)樣中(Neu5Ac, Neu5Gc, 唾液酸參照品, 加上 Neu5,9Ac2 ，如需), 蓋蓋，渦旋徹底混合并短暫離心，確保標(biāo)記溶液位于瓶底部。
• 將樣品、控制樣和標(biāo)準(zhǔn)品置于50°C 爐中暗處培養(yǎng)3小時(shí)
在培養(yǎng)時(shí)，你可以著手調(diào)整LC的檢測(cè)條件用于接下來(lái)的分析 – 參見(jiàn)第4部分.
• 從爐中取出小瓶，加入以下試劑終止反應(yīng)：
往每個(gè)樣品和控制樣中加入475 μL水
往每個(gè)唾液酸標(biāo)準(zhǔn)樣中加入480 μL水
4 LC分析
• 稀釋Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 (使用表1作為指導(dǎo), 通常Neu5Gc含量比Neu5Ac要低一些, Neu5Gc曲線范圍較Neu5Ac的要低一階)。混合均勻。
該項(xiàng)操作可以在液相色譜柱調(diào)節(jié)時(shí)進(jìn)行。
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|
Neu5Ac Std (μL)
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Water (μL)
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Neu5Gc Std (μL)
|
Water(μL)
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1 in 1
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200
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0
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-
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-
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1 in 2
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100
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100
|
|
100
|
100
|
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1 in 5
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40
|
160
|
|
40
|
160
|
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1 in 10
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20
|
180
|
|
20
|
180
|
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1 in 50
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10
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490
|
|
10
|
490
|
|
1 in 100
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10
|
990
|
|
10
|
990
|
|
1 in 1000
|
20 from 1 in 100 (premixed)
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180
|
|
20 from 1 in 100 (premixed)
|
180
|
|
1 in 5000
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-
|
-
|
|
10 from 1 in 50 (premixed)
|
990
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表1. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方案
• 將樣品1加水從1份稀釋到10份 (20 μL 樣品加180 μL水)。
• 將過(guò)程控制標(biāo)準(zhǔn)品用水稀釋10倍 (如使用Neu5,9Ac2，亦稀釋)。
• 不要稀釋 唾液酸參照品(SRP).
注：如果已知樣品的唾液酸化水平較低（如IgG），則不要用水稀釋。如果你發(fā)現(xiàn)液相色譜峰面積不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，那么要么配置更濃的樣品，要么延長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品在10°C下避光的自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)可以至少保持穩(wěn)定72小時(shí)【參考2】。
• 準(zhǔn)備液相系統(tǒng)。應(yīng)確保溶劑管路事先準(zhǔn)備好。
溶劑 A = 乙腈:甲醇:水 9:7:84
溶劑 B = 乙腈
熒光: 激發(fā)波長(zhǎng): 373 nm; 發(fā)射波長(zhǎng): 448 nm
柱溫 = 30°C; 進(jìn)樣溫度 = 10°C
溶劑 B = 乙腈
熒光: 激發(fā)波長(zhǎng): 373 nm; 發(fā)射波長(zhǎng): 448 nm
柱溫 = 30°C; 進(jìn)樣溫度 = 10°C
|
時(shí)間(分鐘)
|
流速 mL/min
|
%A
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%B
|
|
0
|
0.5
|
100
|
0
|
|
19
|
0.5
|
100
|
0
|
|
19.5
|
0.5
|
10
|
90
|
|
23.5
|
0.5
|
10
|
90
|
|
24
|
0.5
|
100
|
0
|
|
30
|
0.5
|
100
|
0
|
表 2. 使用LudgerSep-R1 柱(4.6 x 150 mm, 3 μm 顆粒) LS-R1-4.6x15030 進(jìn)行30分鐘HPLC分析的操作方法。
進(jìn)樣量 = 25 μL.
進(jìn)樣量 = 25 μL.
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時(shí)間(分鐘)
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流速 mL/min
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%A
|
%B
|
|
0
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0.25
|
100
|
0
|
|
7
|
0.25
|
100
|
0
|
|
7.5
|
0.25
|
10
|
90
|
|
8
|
0.25
|
10
|
90
|
|
8.5
|
0.25
|
100
|
0
|
|
15
|
0.25
|
100
|
0
|
表3. 使用LudgerSep-uR 柱(2.1 x 100 mm, 1.9 μm 顆粒) LS-UR2-2.1x100 進(jìn)行15分鐘UHPLC分析的操作方法。
進(jìn)樣量 = 5 μL.
進(jìn)樣量 = 5 μL.
• 使用適當(dāng)?shù)姆椒ǎò幢?使用Ludgersep-R1柱進(jìn)行高壓液相色譜分析，或按表3使用Ludgersep-UR2柱進(jìn)行超高壓液相色譜分析）空進(jìn)樣2到3次調(diào)節(jié)色譜柱。然后進(jìn)一個(gè)系統(tǒng)空白水樣，檢查基線是否穩(wěn)定。如果沒(méi)有，則繼續(xù)進(jìn)水樣直到基線穩(wěn)定，或在重新調(diào)整柱效前，使用10%A和90%B沖洗30分鐘。
• 接下來(lái)進(jìn)2次以上SRP唾液酸參照品，直到譜圖重疊。 HPLC圖譜應(yīng)類(lèi)似于圖1，UHPLC圖譜則與圖2相近。不過(guò)，保留時(shí)間會(huì)因LC系統(tǒng)而異。
• LC系統(tǒng)現(xiàn)在可以進(jìn)行樣本分析。我們建議按以下順序進(jìn)樣（表4）：
SRP 唾液酸對(duì)照品
Neu5Gc 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
Neu5Ac 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
過(guò)程控制標(biāo)準(zhǔn)品 (胎球蛋白; GPEP; 水r; 緩沖液)
樣品
Neu5Gc 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
Neu5Ac 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
SRP 唾液酸對(duì)照品
Neu5Gc 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
Neu5Ac 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
過(guò)程控制標(biāo)準(zhǔn)品 (胎球蛋白; GPEP; 水r; 緩沖液)
樣品
Neu5Gc 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
Neu5Ac 稀釋液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
SRP 唾液酸對(duì)照品
表 4.進(jìn)樣順序
5 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)
• SRP與樣品組的圖譜在開(kāi)始和結(jié)束應(yīng)重疊，且偏移量在 ± 0.1 分鐘。
• 對(duì)于Neu5Gc和Neu5Ac，校正曲線的R2值>0.99。
• 遵循企業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，Ludger對(duì)于胎球蛋白分析驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)為252 到377 nmol/mg 蛋白質(zhì) (例如 34 μg 胎球蛋白 50U酶活)
【參考3】。該驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)隨著更多GCP-FET-50U內(nèi)部數(shù)據(jù)的收集，會(huì)進(jìn)一步更新。在參考文獻(xiàn)3列明了驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的歷史數(shù)據(jù)，并附有詳細(xì)的解釋。
• Ludger企業(yè)內(nèi)部對(duì)于GPEP-A2G2S2分析驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)為5.6 到 8.4 nmol (由定量NMR測(cè)定 ± 20%)
圖 1: DMB標(biāo)記唾液酸參照品(CM-SRP-01)在LudgerSep-R1 HPLC柱跑出的液相圖譜。
峰: 1 = Neu5Gc; 2 = Neu5Ac; 3 = Neu5,7Ac2; 4 = Neu5Gc,9Ac; 5 = Neu5,8Ac2; 6 = Neu5,9Ac2; 7 = Neu5,x,xAc3 ( 此處x表示未知乙酰基位置); * = 試劑。
注:此圖譜僅作為示例。峰寬、分辨率和保留率與實(shí)驗(yàn)室液相色譜系統(tǒng)有關(guān)。
注:此圖譜僅作為示例。峰寬、分辨率和保留率與實(shí)驗(yàn)室液相色譜系統(tǒng)有關(guān)。
圖 2: DMB標(biāo)記唾液酸參照品在LudgerSep-uR2 UHPLC柱跑出的液相圖譜。
峰: 1 = Neu5Gc; 2 = Neu5Ac; 3 = Neu5,7Ac2; 4 = Neu5Gc,9Ac; 5 = Neu5,8Ac2; 6 = Neu5,9Ac2; 7 = Neu5,x,xAc3 (此處x表示未知乙酰基位置); * = 試劑。
注:此圖譜僅作為示例。峰寬、分辨率和保留率與實(shí)驗(yàn)室的液相色譜UHPLC系統(tǒng)有關(guān)。
注:此圖譜僅作為示例。峰寬、分辨率和保留率與實(shí)驗(yàn)室的液相色譜UHPLC系統(tǒng)有關(guān)。
參考文獻(xiàn)及相關(guān)文獻(xiàn)
1. Ludger Document: S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0. Determination of the effect of freezing of DMB Labelled Sialic Acids.
2. Ludger Document: Fetuin Specifications for Sialic Acid Analysis-v2.0. Determination of Acceptance Criteria for Fetuin System Suitability Standard in Sialic Acid Analysis
3. Ludger Document: DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0. Validation of the DMB kit with Ludger Standards.
4. Ludger Document: Application note on ‘Quantitative Sialic Acid Analysis’ #APN002
反應(yīng)機(jī)理
標(biāo)記反應(yīng)是一個(gè)兩步反應(yīng)過(guò)程。
1.首先是閉（環(huán)）形式唾液酸平衡到開(kāi)環(huán)（非環(huán)）形式。
2.第二步系多步機(jī)制，其中DMB染料的伯胺與α-酮酸的羰基反應(yīng)形成亞胺，該中間體與溶液中的還原劑反應(yīng)，再與染料的其它伯胺反應(yīng)。重排后生成帶熒光標(biāo)記的唾液酸（二亞胺）。
故障排除
1.HPLC信號(hào)低
• 酸解不完整: 酸解時(shí)，我們推薦使用烘箱替代加熱元件。 部分加熱元件會(huì)導(dǎo)致樣品瓶中的酸蒸發(fā)和在瓶蓋處凝結(jié)從而導(dǎo)致酸解不完整。我們同時(shí)推薦在酸解時(shí)使用小型樣品瓶,體積不超過(guò)0.5 mL。
• 樣品中的鹽干擾標(biāo)記：鹽和緩沖液會(huì)干擾唾液酸標(biāo)記法。 如果你懷疑鹽對(duì)樣品產(chǎn)生干擾，分析前將樣品透析成無(wú)鹽溶劑。
2. 色譜圖中游離染料峰偏高
• 這可能是由于曝光過(guò)多導(dǎo)致的。請(qǐng)確認(rèn)培養(yǎng)是在暗處避光操作的。一旦樣品標(biāo)記后，建議立即送檢測(cè)HPLC以避免降解，樣品曝露在光和熱源時(shí)間增長(zhǎng)會(huì)引起非唾液酸特征峰的增加。這也可能是由液相色譜長(zhǎng)時(shí)間使用受污染導(dǎo)致，見(jiàn)下文。
• 在10度避光條件下，DMB標(biāo)記的樣品可保存72小時(shí)，因此Neu5Ac和 Neu5Gc的數(shù)量很穩(wěn)定,
前提是校準(zhǔn)在相同條件下儲(chǔ)存并立即進(jìn)行分析【參考文獻(xiàn)3】。如果這個(gè)不能實(shí)現(xiàn)的話，DMB標(biāo)記樣品可以冷凍保存不超過(guò)2天【參考文獻(xiàn)1】。
3.液相色譜峰保留時(shí)間波動(dòng)；基線不穩(wěn)定。
• 不正確的或舊的液相溶劑。始終以相同的方式制備溶劑（例如，通過(guò)將兩種溶劑混合在一起，使一種溶劑在量筒中達(dá)到一升，這與分別測(cè)量?jī)煞N溶劑并在瓶子中混合不同）。等比例梯度對(duì)溶劑制備的變化特別敏感。由于蒸發(fā)，溶劑成分會(huì)隨時(shí)間變化。
• 色譜柱被過(guò)量的游離染料/肽等污染，會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間偏移，譜圖上出現(xiàn)額外的峰。對(duì)于低唾液酸化水平的樣品來(lái)說(shuō)，這個(gè)問(wèn)題更大，因?yàn)榇罅康牡鞍踪|(zhì)被注射到色譜柱里。用常規(guī)洗脫溶劑和乙腈10:90的混合物，以正常流速清洗柱子。
• 液相色譜系統(tǒng)的運(yùn)行條件尚未優(yōu)化。評(píng)估您是否使用UHPLC的一個(gè)常見(jiàn)變量是“強(qiáng)/弱清洗”。這些對(duì)色譜法有顯著的影響。常規(guī)而言，“弱洗”使用較弱的梯度條件，“強(qiáng)洗”使用較強(qiáng)的梯度條件。您需要評(píng)估其中哪一種產(chǎn)生的SRP峰形與產(chǎn)品指南相一致。。我們建議開(kāi)始線使用弱洗滌液進(jìn)行液相色譜優(yōu)化。
4.標(biāo)記溶液中有析出
• 盡管很罕見(jiàn),在制備DMB標(biāo)記溶液（連二亞硫酸鈉、巰基乙醇和DMB混合物）仍有可能發(fā)生輕微的析出。我們?cè)^察到此類(lèi)現(xiàn)象，并檢測(cè)了該物質(zhì)對(duì)標(biāo)記效率的影響，并確定析出物不會(huì)影響標(biāo)記反應(yīng)。
5.唾液酸參照品 (SRP)在 (U)HPLC的圖譜與說(shuō)明書(shū)不一致。
• 請(qǐng)確認(rèn)該參照品未用酸處理。如用酸處理，SRP圖譜的僅包含Neu5Ac 和Neu5Gc相關(guān)的峰。
本產(chǎn)品僅供體外研究用。
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