mRNA疫苗技術解析-關鍵性原料為開發(fā)保駕護航

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2021-08-20 13:16:00【大中小】

mRNA疫苗是一種核酸疫苗，將在體外合成的編碼特定抗原的mRNA序列導入至體內，并表達為相應的抗原蛋白，通過誘導免疫系統(tǒng)針對此抗原蛋白的免疫應答反應，從而達到預防疾病的目的。mRNA疫苗現(xiàn)在主要用來防治多種感染性疾病，如RNA病毒感染性疾病和DNA病毒感染性疾病等。

1、RNA病毒感染性疾病：mRNA疫苗可用于傳染性強、危害性大的RNA病毒感染性疾病的預防，如新冠病毒感染，可在預防新冠病毒感染方面起到重要作用。

2、DNA病毒感染性疾病：mRNA疫苗可用于巨細胞病毒等DNA病毒感染性疾病的預防。

另外，mRNA疫苗還可用于鏈球菌和結核桿菌等細菌感染性疾病。mRNA疫苗具有高效、安全、成本較低等優(yōu)點，但在身體中的表達不夠穩(wěn)定，可能會引起一些局部反應或全身反應等副作用，建議患者在醫(yī)生指導下進行接種，避免出現(xiàn)不必要的危害。

mRNA疫苗究竟是什么

為什么它們在對抗冠狀病毒方面會大有可為？

圖片來源于網絡 http://www.seebio.cn/product.php?id=2510

mRNA疫苗診治(見上圖),是指在體外合成mRNA，將其導入體內，mRNA進入細胞后翻譯表達出抗原蛋白，抗原刺激體內免疫系統(tǒng)，激活體液免疫和細胞免疫，當機體再次接觸同種抗原(細胞/病毒)，可產生快速免疫應答反應，自我保護。與傳統(tǒng)的“滅活”;疫苗(引入削弱或滅活的病毒)不同，mRNA疫苗會教細胞制造一種刺激免疫反應的蛋白質，訓練免疫系統(tǒng)如何處理冠狀病毒Sars-Cov-2。

mRNA技術的應用：

全球累計有超過150種mRNA藥及疫苗研究路線，主要是針對傳染病，腫瘤疾病，蛋白質替代和基因診治層面，目前大多數(shù)的項目研究還處于早期階段，新冠疫情的爆發(fā)，加快了mRNA疫苗的研發(fā)上市。

mRNA疫苗生產工藝流程(來源于網絡)

mRNA疫苗優(yōu)勢：

mRNA疫苗具備安全性高、批次間差異小，具有響應迅速、廉價量產的優(yōu)勢，因此能大幅節(jié)省時間成本及研發(fā)、生產費用，但mRNA疫苗對于存儲條件要求高，需保存在超低溫環(huán)境。與傳統(tǒng)疫苗相比

mRNA疫苗具備以下優(yōu)勢：

1)抗原選擇范圍廣；
2)具備自我佐劑特點，表現(xiàn)更強的免疫原性；
3)具備足夠的安全性。與質粒DNA疫苗相比，mRNA疫苗沒有導入外源基因的遺傳風險，不進入細胞核內部，只在細胞質內表達抗原，起效更快，效果更強。
4)存在多種修飾方法，能夠使mRNA疫苗更加穩(wěn)定，翻譯效率更高，同時納米脂質體遞送方式的發(fā)展能夠使 mRNA 疫苗快速遞送到細胞內從而發(fā)揮功能。
5)不依賴細胞培養(yǎng)技術，可快速構建疫苗。現(xiàn)在的體外轉錄技術能夠很快速、廉價地大規(guī)模生產 RNA 疫苗，相較于傳統(tǒng)活疫苗 5-6個月的生產周期，mRNA疫苗只要有了病毒的基因序列，有望在40天內完成疫苗樣品的生產制備。因此有望更好的應對突發(fā)的傳染病疫情。
6)生物化學合成，生產過程無病毒感染風險。

圖片來源于網絡

疫苗種類	安全性	預防效果	抗體特異性	制備工藝	GMP要求	研發(fā) 周期	生產周期	儲存條件	成本	是否能共享生產線
滅活與減毒疫苗	低	高	低	嚴重依賴佐劑	高	8年以上	5-6個月	2-8℃	低	否
亞單位疫苗	高	中	高	嚴重依賴佐劑	高	8年以上	5-6個月	2-8℃	低	否
腺病毒載體疫苗	中	低	低	佐劑依賴型弱	高	3-5年	約40天	2-8℃	中	可以
mRNA疫苗	高	高	高	不依賴	低	3-5年	約40天	-20℃至-70℃	低	可以

mRNA疫苗開發(fā)流程包括病原體識別、測序、mRNA體外合成和修飾、純化等操作。mRNA疫苗的研究制備需要多種原料來保障疫苗的成功開發(fā)。高產量的mRNA需要mRNA體外合成方法，大規(guī)模生產選擇T7 RNA聚合酶體外轉錄。增強mRNA的穩(wěn)定性，降低免疫原性并提升翻譯效率，解決方案是：使用加帽酶對mRNA進行加帽，使其在細胞內外穩(wěn)定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖體識別，啟動翻譯程序。西寶生物作為國內IVD診斷原料綜合供應商，通過分子酶技術平臺、大規(guī)模蛋白發(fā)酵純化技術平臺，目前已成功開發(fā)各類分子酶相關原料產品。我們可提供一系列mRNA體外合成酶及試劑，解決mRNA疫苗研發(fā)生產的關鍵性原料問題，所有產品均采用藥用規(guī)格原輔料生產，嚴格控制宿主蛋白質殘留、核酸殘留及常見病原體污染，符合GMP規(guī)范的產品生產與質量管理規(guī)程，保障生產過程及所有原輔料可追溯。咨詢訂購可撥打400-021-8158

mRNA疫苗體外合成關鍵步驟及相關產品：

1．生成模板-質粒線性化

相關產品：BsaI限制性內切酶(貨號：EAE0035A)

限制性內切酶Bsa I特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切，可將模板質粒酶切線性化，作為mRNA體外合成模板；

產品特點：

特異性強
受CpG、Dcm甲基化影響，剪切阻斷
受EcoBI甲基化影響，剪切可能受影響
不受Dam甲基化影響

2．mRNA體外合成此步以DNA為模板，在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

相關產品：Seebio® T7 RNA Polymerase,T7 RNA聚合酶 (貨號：EAE0006C)

T7 RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關鍵酶，T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特異識別T7啟動子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。

產品特點：

高度特異識別T7啟動子
5’→3’ RNA聚合酶活性
可用于標記或非標記RNA的合成
可接受生物素、地高辛、熒光蛋白標記的核苷酸作為底物用于RNA的合成
?體外轉錄產生的mRNA，純度高，均一性好。

3．mRNA轉錄后修飾：加帽加尾，對mRNA進行修飾，合成功能完整的mRNA。

由于RNA的穩(wěn)定性較弱，因此合成后的mRNA穩(wěn)定性是必須要關注的問題。通常需要通過在5'端加上帽子結構(Cap1)和3'端加ployA尾加強mRNA的穩(wěn)定性。西寶提供低殘留mRNA加帽的Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)是經過GMP工藝要求生產獲得，滿足疫苗生產所需。

可用于給體外轉錄合成的mRNA催化加上帽子結構(Cap0)，顯著改善mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力，使mRNA可在細胞內表達蛋白，避免核酸外切酶等的降解破壞。進一步形成cap-1結構需要2-O甲基轉移酶(Cat.No:EAE0033B, Seebio)參與，該修飾可以降低RNA在體內引起的細胞先天免疫反應。

3.1 mRNA加帽(Cap0)

相關產品：Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (貨號：EAE0033A)

作用：與3.2mRNA加帽(Cap1)同時進行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結構。

產品特點：

完成mRNA加帽Cap0
提高mRNA的穩(wěn)定性，防止被RNA酶降解
提高mRNA的翻譯效率，提高蛋白產量

3.2 mRNA加帽(Cap1)

作用：與3.1產品 mRNA加帽(Cap0) 同時進行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結構的基礎上，再將Cap0轉化為Cap1結構。

相關產品：mRNA 2'-O-Methyltransferase, GMP Grade(貨號：EAE0033B)

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferas (2'-O-甲基轉移酶)可利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，在 RNA 5'末端緊鄰帽結構(Cap0)的第一個核苷酸的 2'-O 上添加甲基基團，形成帶有Cap1結構的mRNA。Cap1 結構能增強mRNA的翻譯效率，從而可提高轉染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶需要有m7GpppN即7-甲基鳥苷帽結構的RNA作為底物，不會作用于5'末端為pN、ppN、pppN或GpppN的RNA。帶7-甲基鳥苷帽結構(m7GpppN)的RNA可通過Vaccinia Capping System(貨號：EAE0033A)來制備。

產品特點：

使mRNA的Cap 0帽子甲基化為Cap1帽子
提高RNA的翻譯效率，提高蛋白產量
進一步降低免疫原性

產品質量：

生產工藝	GMP工藝生產
殘留	無核酸酶、內毒素含量低
來源	大腸桿菌重組表達
純度高	>95%
純度檢測方法	(SDS-PAGE)電泳
比活	~160U/mg(BCA)

殘留檢測：分別檢測Rnase、核酸酶、切口酶、大腸桿菌DNA殘留，經檢測結果顯示，成品無相關酶的殘留，且表達的宿主DNA殘留也達到了要求標準。

3.3、mRNA加尾(PolyA) ，作用在mRNA的3'端加上PolyA尾。

相關產品：E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (貨號：ECE0567B)

體外轉錄RNA過程中，E.coli Poly(A) Polymerase(加尾酶)不依賴模板的存在，可以催化ATP以AMP的形式依次摻入到RNA的3'末端，即在RNA的3'末端加多聚A尾。Poly(A)聚合酶具有很高的加尾效率，可以在RNA的3'末端加入20~200個A堿基。很大程度還原體內加尾過程。

產品特點：

穩(wěn)定mRNA的存在形式
引導轉錄終止
提高RNA在真核細胞中的翻譯效率

mRNA疫苗研發(fā)生產還有一個很關鍵的步驟那就是遞送系統(tǒng)

保護mRNA，幫助它們進入人體細胞，然后又協(xié)助它們指導細胞生成病毒蛋白的“好幫手”--脂質納米顆粒。可以說，沒有它就沒有現(xiàn)在的mRNA新冠疫苗。

遞送技術平臺是mRNA疫苗的關鍵之一，已經有大量的mRNA制劑系統(tǒng)見諸報道，其中的很多已經進入臨床試驗階段。這些制劑技術都是通過形成特殊的mRNA載體，來實現(xiàn)mRNA疫苗的遞送，這些載體技術包括：魚精蛋白載體技術、納米顆粒脂質體載體技術、多聚體載體技術。

早期使用的脂質體遞送材料是陽離子脂質體。帶正電荷的陽離子脂質體與帶負電荷的mRNA通過經靜電作用聚集形成多層囊狀復合物，稱為脂質體復合物，復合物中包封的mRNA不易被RNase降解，能被成功遞送至細胞翻譯成功能性蛋白。2-二油酰基羥丙基-3-N，N，N-三甲銨氯(DOTAP)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是已被證實遞送載體。陽離子聚合物具有濃縮 mRNA 的作用，mRNA與聚合物濃縮后被陽離子脂質體包裹在囊狀空腔中則形成脂質體聚合物(lipopolyplex，LPR)。LPR早期用于DNA轉染，后來也用于siRNA和mRNA轉染。

脂質體納米粒LN--將mRNA送進細胞的載體

一般由被脂質雙層殼包圍的水性核心組成，脂質雙層殼由不同的脂質組成，每種脂質都發(fā)揮著不同的功能。LNP 是目前主流的遞送載體之一。由于其比較容易被抗原呈遞細胞吸收，在保護mRNA并將其運輸?shù)郊毎斨邪l(fā)揮著舉足輕重的作用。目前三大mRNA疫苗巨頭企業(yè)，Moderna、CureVac和BioNTech均采用了LNP遞送技術。

納米顆粒脂質體(Lipid nanoparticles，LNPs)即LNPs 遞送系統(tǒng)詳情介紹可參閱《沒有脂質體，就沒有新冠mRNA疫苗 - 記新型納米結構脂質體在mRNA疫苗中的應用》

西寶生物作為一家綜合性的服務商，可提供mRNA疫苗研究生產用原料，具體產品訂購詳情如下(400-021-8158)：

產品類別	產品用途	訂購貨號	產品名稱	規(guī)格
mRNA疫苗工具酶
限制性內切酶Bsa I	特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切	EAE0035A	BsaI限制性內切酶	1Ku
加帽酶(RNA加帽)	mRNA的5'端加上Cap0帽結構	EAE0033A	Vaccinia Capping System 牛痘病毒加帽酶	100U
加帽酶(RNA加帽)	mRNA的5'端加上Cap0帽結構	EAE0033A	Vaccinia Capping System 牛痘病毒加帽酶	500U
加帽酶(cap1)	將Cap0轉化為Cap1結構	EAE0033B	mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase, GMP Grade mRNA Cap-2'-O-甲基轉移酶	1Ku,10Ku
加尾酶	在mRNA的3'端加上PolyA尾，l提高RNA在真核細胞中的翻譯效率	ECE0567B	加尾酶	100U,500U
T7 RNA聚合酶	T7 RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關鍵酶	EAE0006C	T7 RNA Polymerase T7 RNA聚合酶	2Ku,10Ku,100Ku
RNA酶抑制劑	mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。RNase Inhibitor可與RNase A形成1：1復合體，對RNase 有極強非競爭性抑制，保護mRNA轉錄后不被降解	EAE0004F	RNase Inhibitor, GMP Grade RNA酶抑制劑	10KU
脫氧核糖核酸酶I	合成后的產物可能會有DNA殘留，在疫苗開發(fā)階段，殘留的去除是關鍵的步驟，以減少下游純化難度并增加產品的純度。	ECE0200E	DNase I, GMP Grade 脫氧核糖核酸酶I	100U,1KU,5Ku
無機焦磷酸酶	RNA合成過程中加入無機焦磷酸酶，去除mRNA合成過程中產生的焦磷酸，提高mRNA產量增加RNA產量。	EAE0034C	Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade 耐熱無機焦磷酸酶	10U
納米顆粒脂質體載體
DMG-PEG2	PEG化脂質，減少粒子在體內與血漿蛋白的結合，延長體循環(huán)時間，用于mRNA疫苗和藥載體。	ECS2196A	DMG-PEG2 二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2	1g
ALC-0159	PEG化脂質，減少粒子在體內與血漿蛋白的結合，延長體循環(huán)時間。用于mRNA疫苗和藥。	ECS2195A	ALC-0159 甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙酰胺	1g
SM-102	陽離子脂質體，mRNA疫苗和藥進入細胞的載體，包載核酸藥，提供正電荷，與帶負電荷的遺傳物質復合，有助于內涵體逃逸。	ECS2194A	SM-102 十七烷-9-基-8-((2-羥乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)	1g
ALC-0315	包載核酸藥，提供正電荷，與帶負電荷的遺傳物質復合，有助于內涵體逃逸，體內轉染，用于mRNA疫苗和藥載體。	ECS2193A	ALC-0315 ((4-羥基丁基)氮雜二烷基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)	1g
膽固醇	膽固醇，介導LNP內吞，穩(wěn)定LNP結構	AJA0003L	膽固醇	25g
二硬脂酰基磷脂酰膽堿	磷脂酰膽堿，輔助型脂質，可以在內吞時加快mRNA的釋放	EGZ0338C	DSPC 二硬脂酰基磷脂酰膽堿	1g
聚乙二醇化磷脂	聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，LNP提高穩(wěn)定性	ECS2002A	MPEG-DSPE, Mw 5K 聚乙二醇化磷脂	1g
聚乙二醇化磷脂	聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，LNP提高穩(wěn)定性	ECS4401A	MPEG-DSPE, Mw 350 聚乙二醇化磷脂	1g
聚乙二醇化磷脂	聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，LNP提高穩(wěn)定性	ECS2012A	MPEG-DSPE, Mw 2K 聚乙二醇化磷脂	1g，10g
mRNA體內遞送聚合物材料
線性聚乙烯亞胺	mRNA疫苗遞送系統(tǒng)用的陽離子聚合物，可適用于多種細胞系轉染	AJL0940B	線性聚乙烯亞胺（PEI 40,000）	10mg,100mg,1g