您需要的大規(guī)模純化外泌體方法來了

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2024-03-06 09:33:00【大中小】

外泌體的概念，研究熱度及應(yīng)用領(lǐng)域在這里就不在贅述，感興趣的可以參考上一篇，初識外泌體。本文著重介紹一種基于PS層析捕獲法的大規(guī)模分離和純化高純度EV的技術(shù)。

眾所周知，由于外泌體在大小，組成和功能方面存在異質(zhì)性，其分離和純化一直面臨著挑戰(zhàn)，加之外泌體的純化分離文獻(xiàn)方法眾多，國際上也沒有限定單一的分離手段，因此根據(jù)需求選擇合適的外泌體分離純化方案，對于外泌體研究至關(guān)重要！

本文介紹的新型PS層析方法支持規(guī)模放大的細(xì)胞培養(yǎng)上清中簡易分離和純化EV。

富士膠片和光采用與金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)系免疫學(xué)的華山教授共同開發(fā)的分離和純化技術(shù)“PS親和法”^[1]，開發(fā)了用于大規(guī)模純化EV的MassivEV™ EV Purification Column PS（MassivEV™ 細(xì)胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS）。配合使用專用的緩沖液MassivEV™ Purification Buffer Set（MassivEV™ 細(xì)胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝），可從支持規(guī)模放大的細(xì)胞培養(yǎng)上清中簡易分離和純化EV。

一純化原理

◆PS親和法利用與EV膜表面的磷酯酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合Tim4（(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4)）的性質(zhì)。在鈣離子存在下，固定在載體上的Tim4可捕獲樣品中的EV。通過清洗去除雜質(zhì)后，加入EV Elution Buffer（螯合劑），低損傷狀態(tài)下從載體上的Tim4的洗脫和純化EV的方法(富士膠片和光開發(fā)的EV分離方法)，該方法可使EV在完整狀態(tài)下高純度分離。

圖1. MassivEV™ EV Purification Column PS（PS親和法）分離和純化細(xì)胞外囊泡的原理

二產(chǎn)品概要

產(chǎn)品組成：MassivEV™ 細(xì)胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS

產(chǎn)品組成：MassivEV™ 細(xì)胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝

MassivEV™ 細(xì)胞外囊泡（EV）純化分離柱 PS

MassivEV™ 細(xì)胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝

三產(chǎn)品優(yōu)勢

使用方便，純度高，形態(tài)完整，耗時短，無儀器需求
可從大規(guī)格（10 mL至1L級別規(guī)格）細(xì)胞培養(yǎng)上清中高效分離和純化高純度EV
只需一個蠕動泵無需切向流過濾（TFF）系統(tǒng)等昂貴設(shè)備
高性價比（處理同一樣品時，可重復(fù)使用分離柱5次）

四操作流程

五應(yīng)用對比

表1 從200 mL間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離和純化EV的對比（富士膠片和光評估）

	MassivEV™	TFF+AEX*	TFF+SEC*
可純化的EV	PS陽性EV	取決于樣品	取決于樣品
純度	高	低	低
純化步驟數(shù)	1個步驟 - PS親和法	2個步驟 -TFF系統(tǒng) -陰離子交換色譜法	2個步驟 -TFF系統(tǒng) 尺寸排阻色譜法
EV粒子產(chǎn)量（參考值）	1.7x10¹¹ particles	1.1x10¹¹particles	0.7x10¹¹particles
純化所需時間	8 h	10 h	10 h

* AEX：陰離子交換色譜法；*SEC：尺寸排阻色譜法

參考：一只小鼠的EV建議給藥量^[²^-⁴^]）：1.0×10⁹particles/mouse

六性能數(shù)據(jù)

6.1 處理樣品量

	1mL	5mL
產(chǎn)品編號	131-19491	137-19493
樣品量*¹	200mL	1L
動態(tài)結(jié)合能力*²	5×10¹¹particles/mL 樹脂	2.5×10¹²particles/5 mL樹脂

*1 MSC細(xì)胞培養(yǎng)上清中一次純化可處理的大概樣品量。樣品處理量因細(xì)胞培養(yǎng)上清中所含的EV粒子數(shù)而異。處理同一樣品時，可重復(fù)使用分離柱，已確認(rèn)最多可使用五次（初次使用1次、重復(fù)使用4次）。

*2 使用MSC來源EV的研究結(jié)果。可能因細(xì)胞種類等條件而異。

6.2 與傳統(tǒng)方法對比

在增殖培養(yǎng)基（MS Culture™/ 10% FBS)及EV生產(chǎn)培養(yǎng)基（EV-Up™）中培養(yǎng)骨髓來源的MSC，回收細(xì)胞培養(yǎng)上清后，使用0.22 μm過濾器過濾。取200 mL經(jīng)過濾處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清用作樣品，采用以下4種方法進(jìn)行分離和純化。純化后的EV溶液分別使用Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)和ELISA進(jìn)行分析。

分離方法

MassivEV™：MassivEV™ EV Purification Column PS / MassivEV™ Purification Buffer Set (本產(chǎn)品, PS親和法)

TFF：僅切向流過濾（500 kDa）

TFF+AEX：切向流過濾（500 kDa）＋陰離子交換色譜法

TFF+SEC：切向流過濾（500 kDa）＋尺寸排阻色譜法

（1）使用NTA 進(jìn)行粒子分析

【結(jié)果】

與TFF相比，MassivEV™ 純化得到的粒子數(shù)量少，但與 TFF+AEX 或 TFF+SEC 相比，MassivEV™ 純化得到的粒子數(shù)量更多

（2）使用CD63 ELISA和CD81 ELISA的EV回收率比較（n=3）

【結(jié)果】

相比傳統(tǒng)方法，使用MassivEV™的EV回收率更高。

參考文獻(xiàn)

1. Nakai, W.et al.:Sci. Rep.6(1), 1(2016).

2. Mansouri, N.et al.:JCI insight,4(21), e128060(2019).

3. Angioni, R.et al.:Int. J. Mol. Sci.,21(22), 8874(2020).

4. Perets, N.et al.:Mol. Autism,11(1), 65(2020).

產(chǎn)品列表

適用于10 mL至1L級細(xì)胞培養(yǎng)上清

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品應(yīng)用
131-19491	MassivEV™ EV Purification Column PS MassivEV™細(xì)胞外囊泡（EV）純化分離柱PS	1mL	基因研究
137-19493		5mL	基因研究
295-96601	MassivEV™ Purification Buffer Set MassivEV™細(xì)胞外囊泡（EV）純化緩沖液套裝	1mL×10次用 (5mL×2次用)	基因研究

以上MassivEV™ EV Purification Column PS、MassivEV™ Purification Buffer Set請配合一同使用

相關(guān)產(chǎn)品

適用于從10 mL以下的細(xì)胞培養(yǎng)上清和體液樣品中分離和純化EV

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品應(yīng)用
294-84101	MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture™外泌體提取試劑盒PS Ver.2	2 tests	基因研究
290-84103		10 tests	基因研究

外泌體ELISA檢測

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品應(yīng)用
298-80601	PS Capture™ Exosome ELISA Kit （Streptavidin HRP） PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（鏈霉親和素HRP）	96T	基因研究

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）增殖用培養(yǎng)基

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品應(yīng)用
132-19345	MSCulture™High Growth Basal Medium MSCulture™ High Growth基礎(chǔ)培養(yǎng)基	500 mL	細(xì)胞培養(yǎng)
133-19331	MSCulture™ High Growth Supplement MSCulture™High Growth添加劑	5 mL	細(xì)胞培養(yǎng)

以上MSCulture™ High Growth基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MSCulture™ High Growth添加劑請配合一同使用

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）EV生產(chǎn)用培養(yǎng)基

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品應(yīng)用
053-09451	Up™ EV Production Basal Medium for MSC, AF EV-Up™間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體生產(chǎn)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，無動物源成分	95mL	細(xì)胞培養(yǎng)
298-84001	EV-Up™MSC EV Production Supplement, AF EV-Up™間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體生產(chǎn)用添加劑，無動物源成分	5mL（100mL用）	細(xì)胞培養(yǎng)

以上EV-Up™基礎(chǔ)培養(yǎng)基、EV-Up™添加劑請配合一同使用

※ 僅供實驗研究用，不可用于臨床診斷。

答疑解惑

Q：Massiv^EV純化分離柱緩沖液套裝適合純化哪些細(xì)胞外囊泡？

A：可提取脂質(zhì)膜表面暴露出磷脂酰絲氨酸（PS）的外泌體和微囊泡。

Q：是不是所有的外泌體都會暴露磷脂酰絲氨酸（PS）呢？

A：迄今為止所發(fā)現(xiàn)的外泌體，并非所有的外膜表面都暴露PS。例如，細(xì)菌來源的外泌體膜表面沒有PS，因此，本款試劑不能提取這種外泌體。

現(xiàn)在的研究尚未得知是否所有的外泌體上都會露出PS，但是上述的外泌體標(biāo)記根據(jù)細(xì)胞種類不同表現(xiàn)出的信號強弱差大，通過利用PS親和法捕捉、提取外泌體是較好的方法。

Q：我們實驗室最近經(jīng)費有限呢，Massiv^E^V 純化分離柱可以循環(huán)利用嗎？

A：使用MSC來源EV的研究結(jié)果表明：處理同一樣品時，可重復(fù)使用分離柱，已確認(rèn)最多可使用五次（初次使用1次、重復(fù)使用4次）。

Q：用該試劑盒提取出來的囊泡怎么判斷是外泌體呢？

A：可以用和表面抗原對應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡（WB）、透射電子顯微鏡（TEM）、納米粒徑分析（如NanoSight LM10）等來驗證。ISEV建議用表面蛋白CD63等來界定所提取的細(xì)胞外囊泡，可使用Wako的PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP)（產(chǎn)品編號298-80601，見上產(chǎn)品列表），既能鑒定外泌體的CD63信號，又能進(jìn)行定量、定性分析，一舉兩得！