微囊藻素( Microcystins,MC)是由藍藻水華所產(chǎn)生的一種肝毒素。80%的藍藻水華都可以檢測出次生代謝產(chǎn)物—微囊藻素,它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性,當(dāng)細胞破裂或衰老時毒素釋放進入水中,同時它還是強烈的肝胺腫瘤促進劑。中國生活飲用水衛(wèi)生標準( GB 5749-2006)的頒布,將飲用水中微囊藻素含量限制為1ug/L,該標準的實施對水源水的質(zhì)量提出了更高的要求。
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ALX-350-012-C050 |
Microcystin-LR |
LR 微囊藻素 |
50μg |
ALX-350-012-C100 |
Microcystin-LR |
LR 微囊藻素 |
100μg |
ALX-350-012-C500 |
Microcystin-LR |
LR 微囊藻素 |
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ALX-350-012-M001 |
Microcystin-LR |
LR 微囊藻素 |
1mg |
ALX-350-148-C025 |
Microcystin-LY |
LY 微囊藻素 |
25μg |
ALX-350-148-C100 |
Microcystin-LY |
LY 微囊藻素 |
100μg |
ALX-350-043-C050 |
Microcystin-RR |
RR 微囊藻素 |
50μg |
ALX-350-043-C100 |
Microcystin-RR |
RR 微囊藻素 |
100μg |
ALX-350-043-C250 |
Microcystin-RR |
RR 微囊藻素 |
250μg |
ALX-350-043-C500 |
Microcystin-RR |
RR 微囊藻素 |
500μg |
ALX-350-043-M001 |
Microcystin-RR |
RR 微囊藻素 |
1mg |
ALX-350-096-C100 |
Microcystin-LA |
LA 微囊藻素 |
100μg |
ALX-350-081-C025 |
Microcystin-LF |
LF 微囊藻素 |
25μg |
ALX-350-081-C100 |
Microcystin-LF |
LF 微囊藻素 |
100μg |
ALX-350-080-C025 |
Microcystin-LW |
LW 微囊藻素 |
25μg |
ALX-350-080-C100 |
Microcystin-LW |
LW 微囊藻素 |
100μg |
ALX-350-044-C025 |
Microcystin-YR |
YR 微囊藻素 |
25μg |
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Microcystin-YR |
YR 微囊藻素 |
100μg |
ALX-804-320-C200 |
Monoclonal Antibody to Microcystin-LR(MC10E7) |
LR 微囊藻素單克隆抗體測試劑 |
200μg |
ALX-850-319-K101 |
Microcystins (Adda specific) ELISA Kit |
微囊藻素試劑盒 |
1Kit |
ALX-804-585-C100 |
Monoclonal Antibody to Microcystins (Adda specific) (AD4G2) |
微囊藻素單克隆抗體測試劑 |
100μg |
微囊藻素介紹
一、概述
隨著社會工業(yè)化進程的加快,人類在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及日常生活中,向水體排入大量含氮、磷的污染物,加速了湖泊的富營養(yǎng)化(Eutrophication),藻類(Algae)由此而獲取豐富的營養(yǎng)而大量繁殖。最近的調(diào)查表明,亞太地區(qū)54%的湖泊富營養(yǎng)化,歐洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分別是53%,28%,48%和41%,我國則是60%。
在富營養(yǎng)化的淡水水體中,當(dāng)有適宜的化學(xué)物理條件時,水體中的藻類短時間內(nèi)大量繁殖并聚集的生態(tài)異常現(xiàn)象稱為水華(Water Blooms, 也稱湖靛);這一現(xiàn)象若發(fā)生在海洋里則通常稱為赤潮(Red Tide)。淡水水體富營養(yǎng)化危害最大的一個表征是水華的出現(xiàn),每年夏、秋季節(jié),在一些淡水湖泊均會形成大量水華,致使水質(zhì)日趨惡化。
當(dāng)水華出現(xiàn)時,水面被厚厚的藍綠色湖靛所覆蓋,甚至在岸邊大量堆積。在藻體大量死亡分解的過程中,不但散發(fā)惡臭,破壞景觀;同時大量消耗水中溶解氧,使魚類窒息死亡;尤其是藻類能釋放生物毒素——藻毒素(Algae Toxins),這些類次級代謝產(chǎn)物嚴重危害人類和其他生物的安全。隨著富營養(yǎng)化的加劇,藻類水華發(fā)生的頻率和幅度也增加,有毒水華對水環(huán)境的危害和生物安全更日益引起廣泛的關(guān)注。
淡水中藍綠藻屬(Cyanobacteria,Blue-green Algae)分泌產(chǎn)生的藍藻毒素是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的污染范圍最廣,研究最多的一類藻毒素。其中的微囊藻素LR (Microcystin-LR)是目前已知的毒性最強的、急性危害最大的一種淡水藍藻毒素。
由于未及時地檢測水質(zhì)情況的污染變化及采取相應(yīng)的控制措施,致使這些毒素富集于魚類或貝類中并通過食物鏈傳遞,直接存在于飲用水或娛樂用水中,嚴重威脅人類的健康,全球已經(jīng)發(fā)生了多起有關(guān)藻毒素中毒并引起死亡的事故。近年來淡水藻類污染已成為一個全球性的環(huán)境問題。
目前,為了保障人民的身體健康,我國現(xiàn)頒布執(zhí)行的生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范(2001,0.001mg/L)和地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB3838-2002。微囊藻素-LR,0.001mg/L)都包含了微囊藻素的檢測項目;世界衛(wèi)生組織(WHO)在其推薦的飲用水標準指導(dǎo)(第二版)中也增加了微囊藻素(MC-LR, 1ug/L)等指標(WHO. 1998),其中都有關(guān)于微囊藻素LR的檢測。
目前對水體中藻毒素的檢測技術(shù)研究還比較落后。大多數(shù)藻毒素使用價格昂貴、體積龐大的HPLC-MS或GC-MS檢測,樣品制備過程復(fù)雜、耗時長,需要專業(yè)技術(shù)人員操作,檢測費用很高。因此限制了常規(guī)監(jiān)測次數(shù)。近年來,美國、德國和日本等國家的科學(xué)家運用免疫技術(shù)結(jié)合計算機、傳感器技術(shù),研究水中藻毒素(尤其是微囊藻素-LR)的原位免疫檢測方法。通過對居民生活飲用水水質(zhì)的監(jiān)測,為居民的身體健康提供保障,為控制和去除水體中的藻毒素提供幫助。
二、微囊藻素的分子結(jié)構(gòu)
微囊藻素是一組環(huán)狀七肽,一般結(jié)構(gòu)為:
環(huán)(-D-Ala-L-X-D-Masp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)
其中:L為左旋;D為右旋。
Masp(有時寫作MeAsp)為D-赤-β-甲基天冬氨酸;
Adda為(2s,3s,8s,9s)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸;
Mdha為N-甲基脫氫丙氨酸。
X和Z為兩種可變的L-氨基酸,目前已發(fā)現(xiàn)下列三種XZ組合的藻毒素毒性較大:LR、RR和YR,其中L、R、Y分別代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨酸)。2、4位氨基酸也是微囊藻素命名的依據(jù)。
構(gòu)成環(huán)狀七肽的七個氨基酸,其中5個是非蛋白質(zhì)氨基酸,2個(2、4點位)是蛋白質(zhì)氨基酸。由于XZ的不同及Masp和Adda的甲基化或去甲基化產(chǎn)生的差異,可以形成多種不同的微囊藻素異構(gòu)體。目前已從不同微囊藻菌株中分離、鑒定了60多種微囊藻素結(jié)構(gòu)。目前已知存在的最普遍、含量相對較多,毒性較大的是主要是MC-LR,MC-RR,MC-YR等數(shù)種,這幾種也是可商品購買的。
三、物理和生化性質(zhì)
藻毒素具有水溶性和耐熱性。易溶于水,甲醇或丙酮,不揮發(fā),抗pH變化。MC-LR的分子式為C49H74N10O12,分子量為995.2(計算時往往按1000計)。
其在水中的溶解性大于1g/L,化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定。在水中藻毒素自然降解過程是十分緩慢的,當(dāng)水中的含量為5ug/L時,三天后,僅10%被水體中微粒吸收,7%隨沙沉淀。藻毒素有很高的耐熱性,加熱煮沸都不能將毒素破壞,也不能將其去除;自來水處理工藝的混凝沉淀、過濾、加氯也不能將其去除。有調(diào)查試驗研究表明在某湖周圍3個自來水廠的出廠水中檢出低濃度的藻毒素(128~1400ng/L),結(jié)果提示采用常規(guī)的飲水消毒處理不能完全消除水體中的藻毒素。
它是一種肝毒素,這種毒素是肝癌的強烈促癌劑。 家畜及野生動物飲用了含藻毒素的水后,會出現(xiàn)腹瀉、乏力、厭食、嘔吐、嗜睡、口眼分泌物增多等癥狀,甚至死亡。病理病變有肝臟腫大、充血或壞死,腸炎出血、肺水腫等。
對于人類健康,微囊藻素也具有很大危害性。其中MC-LR的半致死劑量(LD50)約為50~100 ug/kg。人們在洗澡、游泳及其他水上休閑和運動時,皮膚接觸含藻毒素水體可引起敏感部位(如眼睛)和皮膚過敏;少量喝入可引起急性腸胃炎;長期飲用則可能引發(fā)肝癌。醫(yī)學(xué)部門已發(fā)現(xiàn)飲水中微量微囊藻素與人群中原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有很大相關(guān)性。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障,7個月內(nèi)至少50人死于藻毒素產(chǎn)生的急性效應(yīng),引起舉世矚目的關(guān)注。淡水水體中的藍藻毒素已成為全球性的環(huán)境問題,世界各地經(jīng)常發(fā)生藍藻毒素中毒事件。
四、微囊藻素的危險評價及控制標準
既然水體中的藍藻毒素對人類具有潛在的危害,就有必要對水體中的藍藻毒素進行危險評價。
目前尚沒有強制性的飲水中藻毒素含量衛(wèi)生標準,各國已有飲水中的藻毒素含量標準一般都為微囊藻素-LR的含量。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的飲水中的藻毒素標準為1.0ug/L,加拿大健康組織規(guī)定飲水中可接受的藻毒素標準為0.5ug/L(Guidelines for Canadian Drinking Water Quality, 1993),澳大利亞學(xué)者建議1μg/L的含量為安全飲用水的上限。我國尚未制定飲水中微囊藻素含量標準,在即將頒布的生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范中已將微囊藻素-LR的標準值列入,參照WHO標準,定為0.001mg/L。
根據(jù)表1的數(shù)據(jù),我們可以推測,那些飲用未經(jīng)處理的地表水的人群有攝入藍藻毒素的危險,特別是在藍藻水華發(fā)生的高峰季節(jié)。由此,可以看出藍藻毒素對發(fā)展中國家,特別是農(nóng)村地區(qū)的人群比發(fā)達國家的人群具有更高的危險。但是,飲用經(jīng)處理的地表水的人群并非就沒有攝入藍藻毒素的危險了,因為目前傳統(tǒng)的水處理方法在去除藍藻毒素方面效果并不好。無論對哪一類人群,兒童和嬰兒均比成人具有更高的攝入藍藻毒素的危險。
表1 飲用水中藍藻毒素的最高允許含量 μg·L-1
藍藻毒素 |
嬰兒1) |
兒童 |
成人 |
微囊藻素 |
0.20 |
0.29 |
0.88 |
微囊藻素-LR 2) |
0.07 |
0.11 |
0.32 |
1)嬰兒、兒童和成人的體重分別按5、10、60kg計,每日飲水量分別按0.75、1、2L計;
2)由口服給藥所得結(jié)果;
五、微囊藻素的檢測方法
現(xiàn)在對水體中微囊藻素的檢測已發(fā)展了多種分析方法,主要有生物分析法、化學(xué)分析法和生化分析法。
5.1 生物分析法
傳統(tǒng)的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂評價微囊藻素的毒性。
用純化的微囊藻素或水華藍藻中粗提藻毒素進行測試,根據(jù)其生理病變及半致死量可初步確定其毒性(除個別異構(gòu)體的LD50為200~250μg/kg,多數(shù)微囊藻素的LD50為60~70ug/kg)。這也是毒理評價的常用方法。此外還有用無脊椎動物如蝦、貝、水蚤及其卵進行毒性評價的研究,以細菌進行生物分析也有報道。這類方法靈敏度較差,所得到的毒型結(jié)果與小鼠的品系有關(guān),可比性較差,且無法確定毒素類型及結(jié)構(gòu)。但該方法操作簡單,且可以監(jiān)測到過去未曾發(fā)現(xiàn)的新毒素。
5.2 化學(xué)分析法
化學(xué)分析法主要包括氣相色譜 (GC)、薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/質(zhì)譜分析(LC/MS)及毛細管電泳(CE)等,其中HPLC應(yīng)用最廣。這些方法利用微囊藻素的物化性質(zhì)結(jié)合靈敏的光電技術(shù)對其進行定性、定量分析。
(一)、高效液相色譜(HPLC)
液相色譜可以分析一些氣相色譜無法分析的揮發(fā)性差、極性強、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。常用的檢測器有紫外-可見光(UV-VIS)(ultraviolet- visible)檢測器、示差折光檢測器、熒光、化學(xué)發(fā)光檢測器、火焰離子化檢測器和電化學(xué)檢測器等。
HPLC>技術(shù)一般采用正相或反相色譜柱對毒素進行分離,然后進行紫外、熒光或化學(xué)發(fā)光(CL)檢測。將被測毒素與標準毒素的滯留時間進行比較可對被測毒素進行鑒定,將被測毒素與標準毒素的峰面積進行比較可對其進行精確定量。目前常采用HPLMC進行監(jiān)測,監(jiān)測限度一般為ng級。
高效液相色譜是目前應(yīng)用、研究較多的方法,這一方面取決于微囊藻素本身的物理和化學(xué)性質(zhì),另一方面也因為該法有良好的靈敏度(可達0.1μg/L)和選擇性。其步驟是先將水華藍藻的毒素提取液或?qū)嶋H水樣通過固相萃取吸附富集,溶劑淋洗后將凈化的微囊藻素洗脫,用于定性分析。用于色譜分析。同時,可利用液相色譜的特點,與質(zhì)譜或核磁共振聯(lián)用確定其分子式和結(jié)構(gòu)。
(二)、LC/MS
HPLC監(jiān)測技術(shù)往往需要標準毒素,而目前已發(fā)現(xiàn)60多種MC,多數(shù)缺乏標準毒素,這限制了HPLC的進一步應(yīng)用。LC/MS技術(shù)很好地解決了這一問題,即使沒有標準毒素,只要知道這種毒素的分子量,就可對其進行定性,而且LC/MS技術(shù)亦可對毒素進行精確定量。快速原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)和液相次級離子質(zhì)譜(LSIMS)是確定毒素分子量的有效手段。
(三)、氣相色譜法(GC)
氣相色譜法的一次進樣可以對多種物質(zhì)混合樣品的各個組分進行定性、定量分析。氣相色譜法的優(yōu)點是操作簡單、分離效能高、選擇性強、分析速度快。局限性主要表現(xiàn)在如果沒有標準樣品對照,就無法定性分離組分。用于氣相色譜法的檢測器多達十幾種,如電子捕捉檢測器、氫火焰離子化檢測器、堿離子化檢測器等。其中電子捕捉檢測器只對具有電負性的物質(zhì)(鹵素、硝基、氧原子等化合物)有響應(yīng),而且選擇性強、靈敏度高,廣泛應(yīng)用于有機氯農(nóng)藥和其它含有電負性原子的農(nóng)藥殘留檢測。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS)技術(shù)已經(jīng)比較成熟,結(jié)合了氣相色譜分離特性強和質(zhì)譜儀良好的定性能力,使分離、定量和定性同時進行。但是它的局限性在于只適合于分析可以氣化的樣品。目前高分辨氣相色HRGC-HRMS)(High Respective)技術(shù)可以檢測到單位體積內(nèi)幾個fg的量。如此高的檢測靈敏度也會帶來一些問題,因為樣品可能很快會被接觸到的玻璃容器、試劑甚至是實驗室的空氣所污染。
GC和GC/MS可用于MC總量的測定。
最近又發(fā)展了毛細電泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并應(yīng)用激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)檢測器提高靈敏度。此外,同生化檢測法相比,CE易于實現(xiàn)自動化,避免了放射性物質(zhì)。TLC也是有效的毒素監(jiān)測手段,易于操作,不需特殊設(shè)備,監(jiān)測限度可達ng級,但在監(jiān)測的靈敏度方面要遜色于HPLC。
5.3 細胞毒性檢測技術(shù)
細胞毒性檢測技術(shù)是利用毒素對細胞的毒性作用來監(jiān)測毒素的一種技術(shù),不僅可以判斷毒素存在與否,而且可以對毒素進行精確的定量。這種方法監(jiān)測的也是能發(fā)揮相同毒性作用的毒素的總量。
Fladmark等建立了一種根據(jù)MC導(dǎo)致鮭魚或大鼠肝細胞凋亡的程度來確定MC的方法。他們將分離的鮭魚或大鼠的肝細胞懸浮培養(yǎng),然后加入MC,根據(jù)細胞凋亡的程度即可求出MC的含量,監(jiān)測限度為10~20ng。
動物細胞凋亡的第一個信號是發(fā)生凋亡的細胞與鄰近的細胞分離。根據(jù)這一特性,F(xiàn)ladmark等還建立了用MC導(dǎo)致懸浮培養(yǎng)的鮭魚或大鼠肝細胞解聚的程度來監(jiān)測毒素的方法,所得結(jié)果比用判斷細胞凋亡的程度所得結(jié)果靈敏5~10倍。
5.4 酶活性抑制檢測技術(shù)
由于MC等能夠抑制PP1和PP2A的活性,因此可以通過對酶活性的抑制程度來監(jiān)測這幾種毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制檢測(protein phosphatase inhibition assay, PPIA)技術(shù)以來,這種技術(shù)得到了迅速發(fā)展。PPIA多數(shù)以32P標記的糖原磷酸化酶a為底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解,而PP1和PP2A又可被MC等抑制,因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反應(yīng)后根據(jù)PP水解糖原磷酸化酶a釋放出32P的量就可計算出毒素的量。一般用不同濃度的標準毒素MC-LR作標準曲線,用MC-LR的量來代表總毒素的量。隨著對硝基苯酚磷酸酯(pNPP)可被PP水解現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),人們建立了一種以pNPP為底物的磷酸酶抑制比色監(jiān)測技術(shù),根據(jù)pNPP被水解后產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的多少來確定毒素的量。PPIA的監(jiān)測限度為pg級,它監(jiān)測的是能抑制PP的總毒素的量,而不是某一種毒素的量。但藍藻本身具有的內(nèi)源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的結(jié)果偏低。
5.5 免疫檢測
毒素的免疫監(jiān)測技術(shù)的原理是利用毒素誘發(fā)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體,利用抗體對抗原的特異性識別來對各種毒素進行監(jiān)測。
最早的免疫檢測是免疫化學(xué)技術(shù)中最有效的一種分析方法,1960年由Yalow和Berson開創(chuàng)的,用于檢測血液中的胰島素。從此,免疫檢測廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化學(xué)分析領(lǐng)域,檢測激素、藥品、病毒等。免疫檢測操作非常簡單,但是在環(huán)境污染物檢測分析中的實際應(yīng)用卻非常少。
免疫檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體之間的反應(yīng)。它是以一種抗體或多種抗體作為分析試劑,對待測物進行定量或定性分析的檢測方法。抗體是一種免疫球蛋白,它是動物機體對外來物質(zhì)(抗原)發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的。抗體可以和抗原物質(zhì)形成抗原-抗體復(fù)合物。在免疫化學(xué)分析方法中,未反應(yīng)的抗原和抗體被稱作自由相,抗原- 抗體復(fù)合物被稱作結(jié)合相。抗原和抗體之間的反應(yīng)具有特異性,并且非常靈敏。這些特性對于動物機體防御疾病和免疫檢測都非常重要。隨著樣品檢測費用的不斷提高和檢測項目的不斷增加,發(fā)展了免疫化學(xué)檢測方法;另一方面,對快速、簡單的原位檢測的需求,也促進了免疫檢測的發(fā)展。免疫檢測可以廣泛地用于檢測許多不同的化合物。
自80年代開始,酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)開始用于MC的監(jiān)測。水質(zhì)免疫檢測中最常用的檢測方法是競爭性非勻相酶聯(lián)免疫檢測。在這個檢測方法通常將抗體包被在96孔板(聚苯乙烯微量滴定板)的微孔底部,或者其他固定相上。把酶標記在已知濃度半抗原上,以便產(chǎn)生可以檢測的信號。在待測半抗原和已知濃度的酶標記和抗體形成復(fù)合物之后,將剩余的試劑洗脫,加入酶的底物,產(chǎn)生顯色反應(yīng)。根據(jù)顏色的深淺,定量抗原,或者根據(jù)是否顯色,判別樣品中是否有分析物存在。
Chu等人首先提出了應(yīng)用ELISA監(jiān)測MC的完整程序,他們將MC-LR與牛血清蛋白偶聯(lián),用得到的偶聯(lián)物免疫兔制備兔抗MC-LR多克隆抗體(PAb),然后將MC-LR與辣根過氧化物酶偶聯(lián),以鄰苯二胺(OPD)為底物用直接競爭法做ELISA。用不同濃度的標準毒素MC-LR作標準曲線,根據(jù)底物的顯色程度與標準曲線作比較即可求出毒素的含量,監(jiān)測限度為0.20μg/L。他們發(fā)現(xiàn)抗MC-LR PAb與MC-LR,-RR,-YR有較好的交叉反應(yīng)性,但與MC-LY,-LA的交叉反應(yīng)性低。An和Carmichael證實了Chu等的觀點,并提出C-6上為E-型的Adda和Arg對毒素的抗原性是必需的。McDermott等用從雞蛋黃中提取的抗MC-LR PAb做ELISA監(jiān)測毒素,發(fā)現(xiàn)監(jiān)測限度為95ng/L。這種方法制備的抗體產(chǎn)量大,方法簡便,而且對MC-LR和-RR有良好的交叉反應(yīng)性。盡管抗MC的單克隆抗體(MAb)很早就已制備,但直到1995年才由Nagata等建立起一整套完整的ELISA監(jiān)測技術(shù),其監(jiān)測限度為25ng/L。最近,他們又制備了能夠特異性的識別抗MC-MAb和MC形成的免疫復(fù)合體(immune complex)但不與MC或抗MC MAb反應(yīng)的單克隆抗體,并建立了一種三明治監(jiān)測技術(shù),監(jiān)測限度為2ng/L。目前已有針對MC的ELISA試劑盒可以買到,這大大方便了毒素的監(jiān)測工作。但目前的試驗表明抗體往往只是針對某一種毒素建立起來的,對某些毒素的交叉反應(yīng)性低,不能監(jiān)測所有的毒素。有研究表明,將分別針對某一種毒素做ELISA所得結(jié)果加起來后與用小鼠法所得結(jié)果有很好的一致性。
酶聯(lián)免疫法由于具有靈敏、快速、簡單、便攜、易用、適用現(xiàn)場分析等特點,顯示出良好的發(fā)展趨勢。
常規(guī)的理化檢測儀器,特別是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀器體積龐大、價格昂貴、需要環(huán)境條件較高的室內(nèi)環(huán)境、而且還需要專門的技術(shù)人員操作,因此檢測費用居高不下($40-200/樣品);磷酸酶抑制試驗和細胞試驗雖然都能很好地檢測出毒素,但是靈敏度太低,甚至不能有效地檢測出WHO推薦的1mg/L;同時,環(huán)境監(jiān)測的項目、樣品數(shù)量不斷增多,檢測限不斷提高。免疫分析是基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的分析方法,檢測靈敏度高、特異性強、分析容量大、反應(yīng)速度快、檢測費用低廉($5-10/樣品)。因此,免疫分析技術(shù)受到了各國的重視。美國、德國在80年代末開始研究免疫檢測方法,世界糧農(nóng)組織(FAO)已經(jīng)相許多國家推薦這項技術(shù)。因而開發(fā)和利用免疫檢測技術(shù)是有前景的,美國國家環(huán)保局(EPA)目前推行的幾種用于檢測環(huán)境中microcystins的方法按先后順序依次為:
• Immunoassay
• Bioassay
• Protein phosphatase assay
• HPLC
• LC/MS
由于微量藍藻毒素對人類危害嚴重,迫切需要對水體中特別是做為飲水水源的湖泊、河流和水庫中的藍藻毒素進行連續(xù)監(jiān)測。上面提到的監(jiān)測技術(shù)是針對分布廣、毒性大的微囊藻素建立的,這些監(jiān)測技術(shù)各有其優(yōu)點和缺點,對比如表2所示。
表2 微囊藻素監(jiān)測技術(shù)的優(yōu)缺點
監(jiān)測技術(shù) |
優(yōu)點 |
缺點 |
小鼠法 |
毒素的有害效應(yīng)易檢測到 |
不能區(qū)分微囊藻素的異構(gòu)體 |
操作簡單 |
工作量大;倫理問題 |
HPLC |
對不同毒素可進行定性和定量 |
毒素需預(yù)處理;靈敏度較低 |
設(shè)備龐大、昂貴;需專業(yè)人員 |
ELISA |
可檢測到毒素的不同同系物 |
對多種同系物的識別需要廣譜抗體;商品化的試劑盒可靠性需進一步檢驗;標準不統(tǒng)一 |
商品試劑盒的出現(xiàn)大大方便了操作 |
高靈敏度 |
PPIA(放射標記或顯色) |
只監(jiān)測PP1和PP2A的抑制劑 |
測定毒素總量,不能區(qū)分特異的毒素同系物 |
高靈敏度 |
需要新制備的放射性底物;放射性廢物的處理困難 |
細胞毒性監(jiān)測 |
用原代肝細胞可獲得高靈敏度 |
原代肝細胞的生產(chǎn)工作量大 |
用建立的細胞系可方便實驗 |
建立的細胞系往往靈敏度較低 |
HPLC:高效液相色譜;ELISA:免疫吸附測定;PPIA:蛋白磷酸酶抑制測定;PP:蛋白磷酸酶。