狂犬病作為危害人類(lèi)健康的古老的疾病之一，流行于世界大多數(shù)的國(guó)家和地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年都有不少于4000人死于狂犬病發(fā)作。狂犬病疫苗作為對(duì)抗狂犬病的有效方法也隨之經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程。目前世界上存在很多狂犬病疫苗的生產(chǎn)技術(shù)，可以應(yīng)用細(xì)胞毒株制備狂犬病地鼠腎細(xì)胞純化疫苗。將狂犬病CaG株在原代地鼠腎細(xì)胞傳代適應(yīng)，用病毒培養(yǎng)液上清作為產(chǎn)生用毒種，結(jié)果通過(guò)在地鼠腎細(xì)胞傳10代左右，適應(yīng)后病毒液度較高。
1生產(chǎn)流程
細(xì)胞制備 →種子批建立→種子檢測(cè)→病毒接種和培養(yǎng)→病毒收獲
→病毒滅活→合并、濃縮、純化→原液檢定→分裝及凍干
2主要流程簡(jiǎn)單說(shuō)明
2.1細(xì)胞制備
生產(chǎn)用細(xì)胞為原代地鼠腎細(xì)胞或連續(xù)傳代不超過(guò)5代的地鼠腎細(xì)胞。
選用12—14日齡地鼠，無(wú)菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，分散細(xì)胞，接種培養(yǎng)瓶，
用適宜的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。來(lái)源于同一批地鼠、同一容器消化制備的地鼠腎細(xì)胞為一個(gè)
細(xì)胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制備的多個(gè)細(xì)胞消化批為一個(gè)細(xì)胞批。培養(yǎng)液為含適量滅活小牛血清和乳蛋白水解物的MEM，199或其他培養(yǎng)液。
2.2種子批的建立
生產(chǎn)用毒種為狂犬病病毒固定毒aG株或其他經(jīng)地鼠細(xì)胞適應(yīng)的狂犬病病毒固定毒株。原始種子批為2aG1，主種子批應(yīng)不超過(guò)4aG。毒種在地鼠腎原代細(xì)胞和豚鼠腦內(nèi)交替?zhèn)鞔苽涔ぷ鞣N子批，在地鼠腎原代細(xì)胞的傳代應(yīng)不超過(guò)第6代，即不超過(guò)10aG；在豚鼠腦內(nèi)傳代應(yīng)不超過(guò)第5代，即10aG5。
2.3種子檢測(cè)
用小鼠腦內(nèi)中和試驗(yàn)鑒定毒種的特異性。將毒種作10倍系列稀釋?zhuān)∵m宜稀釋度病毒液與等量狂犬病病毒特異性免疫血清混合，同時(shí)設(shè)立正常血清對(duì)照組，試驗(yàn)組與對(duì)照組的每個(gè)稀釋度分別接種11-13g小鼠6只，每只腦內(nèi)接種0.03ml，觀(guān)察14天，中和指數(shù)應(yīng)不低于500。
取毒種作10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度腦內(nèi)接種體重為11-13g小鼠至少6只，只腦內(nèi)接種0.03ml，觀(guān)察14天，病毒滴度應(yīng)不低于8.0LgLD50/ml。
用主種子批毒種制備滅活疫苗，腹腔注射體重為12-14g小鼠，每只0.5ml。7天后重復(fù)接種1次作為試驗(yàn)組，未經(jīng)免疫小鼠做對(duì)照組。第一次免疫后的第14天，試驗(yàn)組和對(duì)照組分別用10倍系列稀釋的CVS病毒腦腔攻擊，每只0.03ml，每個(gè)稀釋度10只小鼠。保護(hù)指數(shù)應(yīng)不低于100。
2.4病毒接種和培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)成致密單層后，毒種按0.01－0.1MOI接種（同一工作種子批應(yīng)按同一MOI接種），置適宜溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS或其他適宜洗液沖洗去除牛血清，加入適量維持液，置33-35℃繼續(xù)適當(dāng)時(shí)培養(yǎng)間。
2.5病毒收獲
經(jīng)培養(yǎng)適宜時(shí)間收獲病毒液，即為病毒單次收獲液。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可換以維持液進(jìn)行多次病毒收獲。同一細(xì)胞批的同一次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。
2.6病毒滅活
病毒收獲液中按1：4000的比例加入甲醛溶液（應(yīng)在規(guī)定的蛋白濃度范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活），置適宜溫度、在一定時(shí)間內(nèi)滅活病毒。病毒滅活到期后，每個(gè)滅活容器應(yīng)立即取樣，分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。
2.7合并、濃縮、純化
同一細(xì)胞批制備的多個(gè)單次病毒收獲液檢定合格后可合并為一批，經(jīng)超濾或其他適宜方法濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)濃度范圍。經(jīng)濃縮后的病毒液采用柱色譜法或其他適宜的方法純化。純化后可加入適量人血白蛋白作為穩(wěn)定劑，即為原液。
3總結(jié)
通過(guò)對(duì)狂犬病毒aG株在金黃地鼠腎細(xì)胞上傳代培養(yǎng),獲得一種新型狂犬病毒毒株,即地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)株(CaG株)。由于該毒種具有生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單,成本低廉,且外源因子污染機(jī)率小等優(yōu)點(diǎn),因此試用該毒種生產(chǎn)精制狂犬病疫苗。相同條件下,分別用豚鼠腦毒種和細(xì)胞毒種各生產(chǎn)3批病毒原液,經(jīng)相同純化工藝制備成精制狂犬病疫苗。經(jīng)初步檢定用細(xì)胞毒種制備的疫苗安全性良好,疫苗免疫效價(jià)與豚鼠腦毒種疫苗無(wú)明顯差異。
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