層析操作通常包括裝柱、平衡、進料、淋洗、洗脫、再生等步驟。具體的操作方法如下（以20 cm×1.6 cm I.D., H=7.5 cm, CV=15 mL為例）：

1. 平衡：用5~10CV的平衡緩沖液（Buffer A，如20 mM PB, pH7.0，具體的緩沖體系應根據(jù)目標蛋白的穩(wěn)定性和等電點、離子交換介質(zhì)的種類進行篩選和優(yōu)化）以2-5mL/min的流速平衡層析柱，至流出液電導和pH不變（與平衡液一致）。
2. 進料：樣品緩沖液應盡可能與平衡液一致。固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析或添加相應量的鹽；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應經(jīng)離心或微濾（0.45 μm）處理。進料量根據(jù)介質(zhì)的載量和料液中目標蛋白的含量計算。
3. 淋洗：以2-5 mL/min的流速上樣，并繼續(xù)用平衡緩沖液淋洗至基線。
4. 洗脫：用洗脫緩沖液（20 mM PB+1 M NaCl, pH7.0，也可采用pH梯度洗脫）以2-5mL/min的流速洗脫（可采用線性梯度洗脫或階越梯度洗脫），收集流出液。
5. 再生：每次層析之后可用1-2 M NaCl清洗層析柱，除去強結(jié)合的蛋白。

6. 原位清洗：介質(zhì)使用數(shù)次（具體次數(shù)與原料的種類和來源及實驗要求有關）后，需要對介質(zhì)進行在位清洗：

   （1）對于通過離子鍵強結(jié)合的蛋白，可用2 M NaCl以1-2 mL/min的流速反向清洗10-15 min；
   （2）對沉淀蛋白、疏水性結(jié)合的蛋白、脂蛋白，可用1 M NaOH以1-2 mL/min的流速反向沖洗3-4 CV；
   （3）對強疏水性結(jié)合的蛋白、脂蛋白和脂類物質(zhì)，可用70%乙醇或30%異丙醇以1-2 mL/min的流速反向沖洗3-4 CV（使用高濃度的有機溶劑時，為了避免產(chǎn)生氣泡，應采用逐步增加有機溶劑濃度的方法）。
7. 保存：4-30℃下20%乙醇中保存（4℃下有利于長期保存）；層析柱中的介質(zhì)可用20%的乙醇沖洗后保存于4-30℃。
8. 其它注意事項：在裝柱、使用和保存柱子的時候，要避免柱子流干或密封不嚴，防止氣泡進入。