聚乙二醇主鏈ELISA試劑盒使用說明書

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2020-04-13 16:03:00【大中小】

聚乙二醇主鏈ELISA試劑盒使用說明書

用于測量聚乙二醇和聚乙二醇結(jié)合蛋白的ELISA試劑盒

在使用操作ELISA試劑盒之前，請務(wù)必先徹讀以下介紹。

使用目的：該試劑盒僅供科研用途使用。不得用于治療或診斷用途

介紹：生物制品通過與聚乙二醇結(jié)合，延緩了蛋白質(zhì)降解，降低了被循環(huán)系統(tǒng)清除的速率，從而延長了半衰期（參考文獻(xiàn)1）。聚乙二醇結(jié)合蛋白的藥物動力學(xué)通常使用特異性檢測蛋白質(zhì)含量來評估確認(rèn)。該方法不僅耗時，而且需要開發(fā)昂貴的針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法（ELISA）。由Life Diagnostics生產(chǎn)的聚乙二醇 ELISA 試劑盒，可以測量聚乙二醇結(jié)合蛋白中的聚乙二醇部分，因此適合一些列聚乙二醇結(jié)合蛋白的藥物動力學(xué)評估。

背景：檢測方法為直接競爭性ELISA法。 BSA (牛血清白蛋白) 與甲氧基聚乙二醇單鏈通過共價鍵結(jié)合，涂布在96孔板的微孔中。經(jīng)稀釋的樣品和含有聚乙二醇結(jié)合蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶(50µl) 加入微孔中。然后將辣根過氧化酶結(jié)合抗-PEG抗體（50μl）添加到孔中，并將孔板在孔板振蕩器上培養(yǎng)1小時。洗滌微孔后，將 TMB (100 µl HRP酶底物), 添加到孔中培養(yǎng)20分鐘, 形成藍(lán)色。加入1N鹽酸 (100 µl)停止顯色，此時溶液顏色轉(zhuǎn)為黃色，測定450nm處的吸光度。如果樣品中存在聚乙二醇，會和板上固化的聚乙二醇爭奪與HRP結(jié)合抗聚乙二醇抗體的結(jié)合，從而導(dǎo)致吸光度值下降。 ELISA試劑盒中使用的抗體是由Life Diagnostics 開發(fā)的小鼠單克隆抗體 (clone 1D9-6) ，對聚乙二醇主鏈具有特異性。Life Diagnostics的研究表明該試劑盒可用于檢測包含一條或多條的聚乙二醇鏈的蛋白質(zhì)，也可以檢測未結(jié)合的聚乙二醇。靈敏度隨著聚乙二醇鏈長和聚合度的不同而變化（參見表1），因此建議生成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于檢測不同的聚乙二醇或聚乙二醇結(jié)合分子。試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，是結(jié)合了單條20kDa甲氧基聚乙二醇鏈的BSA. 因此終端用戶可以籍此確認(rèn)試劑盒的性能。

PEG	EC50 (ng/ml)
BSA-(mPEG 20 kDa)3-7	1.0 +/- 0.1
BSA-mPEG 20 kDa	3.6 +/- 0.5
BSA-PEG 10 kDa	9.4 +/- 1.1
BSA-mPEG 5 kDa	111 +/- 22
20 kDa mPEG	0.70 +/- 0.15
10 kDa PEG	0.59 +/- 0.16
5 kDa mPEG	4.65 +/- 2.32

表1. 高靈敏度聚乙二醇ELISA試劑盒中聚乙二醇結(jié)合BSA和未結(jié)合聚乙二醇的特征值。請注意聚乙二醇結(jié)合BSA的濃度僅指多肽部分，而不包括由聚乙二醇引入的物質(zhì)。EC50值指的是由3-6次檢測得到的 +/- SD的平均值。

儲存： 收到HRP抗聚乙二醇抗體小瓶后，聚乙二醇結(jié)合BSA標(biāo)準(zhǔn)品和PEG涂布的96孔板應(yīng)即刻置于-20℃的冷凍箱中保存直至使用。請勿置于更低的溫度下保存。試劑盒的其余組成應(yīng)置于2-8℃的冰箱中保存。微量檢測條應(yīng)置于包含干燥劑的密封袋中保存，以盡可能避免潮濕空氣影響。如試劑盒部件按上述方法妥善保存，測試試劑盒自購買之日起，保持穩(wěn)定6個月。在使用前，孔板，稀釋劑和TMB試劑應(yīng)平衡至室溫，這點很重要。

物料

試劑盒提供的物料：

涂布聚乙二醇的 Microtiter 96孔板 (12 條8孔可拆卸板條)。-20℃下保存。
HRP結(jié)合抗聚乙二醇抗體, 1 小瓶。 -20℃下保存。
HRP結(jié)合聚乙二醇稀釋劑, 50 ml
PEG-BSA標(biāo)準(zhǔn)品, 1小瓶。* -20℃下保存。
HRP PEG洗滌緩沖液 (20x stock), 50 ml
TMB試劑, 11 ml
終止液, 11 ml

需要用到但試劑盒未包含的物料：

精密移液器和吸頭
蒸餾水或去離子水
聚丙烯管或玻璃管
漩渦混合器
吸水紙或紙巾
微孔板培養(yǎng)箱/振蕩篩 (混合速率 ~150 rpm)
洗板機(jī)
讀板器，450nm下光密度范圍0-4
繪圖軟件

試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將8個聚丙烯管或玻璃管分別標(biāo)記為1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064 和0 ng/ml。
按照PEG標(biāo)準(zhǔn)品小瓶標(biāo)簽上的方法制備1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。
分別將200μl稀釋液加入標(biāo)有200、40、8、1.6、0.32、0.064和0 ng/ml的試管中。
將1000 ng/ml的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液用移液器轉(zhuǎn)移50 μl轉(zhuǎn)移至標(biāo)有200 ng/ml的試管中并混合均勻。由此獲得 200 ng/ml PEG-BSA 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
依次進(jìn)行類似的5倍稀釋可分別制備40, 8, 1.6, 0.32 和 0.064 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品制備

聚乙二醇結(jié)合蛋白在血清或血漿里的濃度與許多因素有關(guān)：注射途徑，注射量，注射后收集血清或血漿的時間。由于這些變量都是由用戶確定的，因此需要根據(jù)經(jīng)驗來確定適合的稀釋程度。

HRP 結(jié)合抗-PEG抗體制備

確定所需結(jié)合物的體積 (0.5 ml 每 8個孔板條帶) ，然后按小瓶標(biāo)簽標(biāo)示使用稀釋溶液稀釋HRP結(jié)合抗-PEG抗體。制備后應(yīng)盡快使用。

洗滌溶液制備

洗滌溶液是以20倍貯存液的形式提供。使用950毫升蒸餾水或去離子水稀釋瓶內(nèi)容物（50毫升）。

分析過程

確保涂布板孔的數(shù)量足夠用。
將50μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入孔內(nèi)（建議標(biāo)準(zhǔn)品和樣品一式三份進(jìn)行測試）。
向每個孔中加入50μl的HRP結(jié)合抗-PEG抗體。
在室溫（25°C）下，以150轉(zhuǎn)/分的速率在微型平板振動篩上培養(yǎng)1小時。
使用洗板機(jī)，用400μl清洗緩沖液清洗板孔共6次。
用吸水紙或紙巾充分擦拭板孔，以去除殘留液滴。
將100μl TMB試劑加入各個板孔。
以150轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在微板振動篩上輕輕混合20分鐘。
加入100μl終止溶液到每個板孔，來停止反應(yīng)。
輕輕混合，直到所有藍(lán)色變成黃色。
在5分鐘內(nèi)用孔板讀數(shù)器讀取450 nm處的吸光度。

結(jié)果計算

使用計算機(jī)圖形軟件用于結(jié)果計算。

計算每組參考標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度平均值(A450)。
通過測得的每個參考標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度，與其濃度以10為底的對數(shù)log10（ng/ml）的比值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，垂直軸或Y軸為吸光度，水平軸或X軸為濃度。
將數(shù)據(jù)擬合到Sigmoidal函數(shù)量效關(guān)系模型（可變斜率）。曲線上限可以用0 ng/ml空白標(biāo)準(zhǔn)品測定值修正，曲線下限可以用1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品的測定值修正。
根據(jù)每個樣品的平均吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到相應(yīng)聚乙二醇化蛋白質(zhì)以10為底的對數(shù)濃度，并通過逆以10為底對數(shù)計算得出濃度（ng/ml）。
強(qiáng)烈建議僅使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中間50%范圍內(nèi)的樣品吸光度值來確定PEG濃度。例如，如果吸光度的下限（0 ng/ml）和上限值分別為1.6和0.1，則僅采用位于1.225和0.475范圍內(nèi)的樣品吸光度值。
用推導(dǎo)出的濃度乘以稀釋因子，以確定血清/血漿樣本中聚乙二醇化蛋白質(zhì)的實際濃度。
如果樣品的A450值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效范圍，則應(yīng)適當(dāng)稀釋樣品并重新測試。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線

下面顯示了一個典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在Y軸上的在450nm的吸光度讀數(shù)，在X軸上為 20 kDa BSA-甲氧基聚乙二醇的濃度。請注意，X軸是以10為底的對數(shù)刻度。

峰值/回收率數(shù)據(jù)

Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）血清加入了所示濃度的20 kDa BSA-甲氧基聚乙二醇，回收率則使用PEG-ELISA P-0003進(jìn)行估算。

發(fā)現(xiàn)正常大鼠血清中含有可測量的聚乙二醇，可能來自膳食來源。

重要提示

切勿將疊氮鈉作為防腐劑添加到血清或血漿樣本中。疊氮化物是HRP的抑制劑，會使分析無效。
建議使用洗板機(jī)用于微孔板清洗。僅使用試劑盒提供的清洗緩沖液。在使用前用蒸餾水或去離子水洗滌洗板機(jī)所有的管道和器皿，并用清洗緩沖液徹底洗滌。
制備標(biāo)準(zhǔn)品時，通常使用多道移液器在空白聚丙烯96孔板上進(jìn)行恰當(dāng)?shù)倪B續(xù)稀釋操作。樣品也同樣制備，并/或分配到空白96孔板用于酶聯(lián)免疫的位置。這樣使用多道移液器可保樣品和標(biāo)準(zhǔn)品快速簡便地轉(zhuǎn)移到酶聯(lián)板上。
如使用試劑盒之外的標(biāo)準(zhǔn)品，建議使用10倍稀釋液來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，從10 μg/ml濃度開始。使用單條8孔板條，可毫不費力地確定從0.1 ng/ml到10 μg/ml 濃度范圍。然后通過微調(diào)獲得可用的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
所有試劑在使用前必須達(dá)到室溫（18-25攝氏度）。
在添加HRP結(jié)合抗PEG抗體之前，始終先將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品添加到微孔中。
請勿使用自備緩沖液替代試劑盒提供的緩沖液（例如稀釋液或洗滌緩沖液）。許多市售材料含有聚乙二醇或聚乙二醇結(jié)合分子，這將影響試劑盒的性能。因此，應(yīng)小心選擇用于聚乙二醇結(jié)合蛋白研究的其他組份。
吐溫-20是一種含有聚氧乙烯的洗滌劑，常用于ELISA稀釋和洗滌緩沖液。它會干擾本酶聯(lián)免疫吸附試驗盒。其他聚氧乙烯洗滌劑亦如是。
不要把疊氮化物作為防腐劑添加到血清或血漿樣本中。疊氮化物是HRP的抑制劑，會使分析無效。
建議使用洗板機(jī)清洗微孔。務(wù)必使用試劑盒附帶的清洗緩沖液。使用前用蒸餾水或去離子水清洗洗板機(jī)的所有管路和容器，并用清洗緩沖液徹底清洗洗板機(jī)。
制備標(biāo)準(zhǔn)品時，通常使用多道移液器在空白聚苯乙烯96孔板中進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪B續(xù)稀釋。樣品制備和/或分配到在ELISA中預(yù)置的空白96孔板中。使用多道移液器將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品快速簡便地轉(zhuǎn)移到ELISA板上。
如采用試劑盒預(yù)置以外的標(biāo)準(zhǔn)品，建議使用10倍稀釋液來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，起始濃度從10μg/ml開始。使用單個8孔板條，濃度范圍0.1 ng/ml至10μg/ml的檢測會更便宜些。然后再微調(diào)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

參考文獻(xiàn)

1. Webster R, et al. PEGylated Proteins: Evaluation of their safety in the absence of definitive metabolism studies. Drug Metabolism and Disposition 35:9-16 (2007)