EGFR基因突變，基因編輯技術(shù)揭示癌癥耐藥性途徑

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2024-11-18 14:24:00【大中小】

摘要：研究人員使用堿基和引物編輯來發(fā)現(xiàn)影響癌癥進展和耐藥性的新的EGFR基因突變。

通過結(jié)合先進的基因編輯技術(shù)，科學(xué)家們確定了影響肺癌腫瘤生長和耐藥性的關(guān)鍵突變，為量身定制的癌癥治療提供了新的途徑。

在最近發(fā)表在《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上的一項研究中，瑞士的研究人員使用堿基和引物編輯技術(shù)，在多種細胞系（包括癌細胞和非癌細胞）中創(chuàng)建和分析了上皮生長因子受體（EGFR）基因的各種變體，以研究它們對癌癥進展和耐藥性的影響。他們發(fā)現(xiàn)，以前已知的和新的突變都與EGFR激活和藥物反應(yīng)顯著相關(guān)，證明了該方法的準(zhǔn)確性，并揭示了影響腫瘤生長和耐藥性機制的新途徑。

圖1 利用堿基和素數(shù)編輯對遺傳變異進行多模態(tài)掃描

盡管基因組測序取得了進展，但一些遺傳變異仍被歸類為不確定意義變異（VUS），使疾病的診斷和治療復(fù)雜化。這在非小細胞肺癌（NSCLC）相關(guān)的EGFR變異中尤其明顯，其中約50%的EGFR變異是VUS。目前的治療方法，包括靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（TKIs），對非典型突變的效果較差，導(dǎo)致預(yù)后不佳和耐藥。新的方法，如多重檢測和基于聚類、定期間隔的短回文重復(fù)（CRISPR）的篩選，有助于評估變異，但它們目前缺乏分析所有可能突變所需的規(guī)模、特異性和準(zhǔn)確性。

堿基編輯技術(shù)提高了準(zhǔn)確性，但受到意外編輯和限制性突變類型的限制。Prime編輯是一種更先進的方法，可以精確地引入多種突變，包括插入和缺失，為評估VUS的致病性提供了一種高通量方法，并為個性化癌癥治療開辟了新的途徑。在本研究中，研究人員使用堿基和引物編輯的組合對EGFR基因的整個編碼序列進行高分辨率突變掃描，以鑒定與各種細胞類型的癌癥進展和耐藥性相關(guān)的已知和新的突變。

研究人員使用依賴野生型EGFR生長的MCF10A細胞來評估EGFR變異的致病性。他們在EGFR中引入了特異性突變，通過慢病毒傳遞，使用胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器（BE3.9max和ABE8e）促進激活，使用1,496個單導(dǎo)核糖核酸（sgRNAs）庫靶向所有EGFR外顯子和關(guān)鍵調(diào)控位點。在編輯和剝奪EGF之后，研究人員對sgRNAs進行測序，以鑒定影響細胞活力的突變。在后續(xù)篩選中，他們通過用吉非替尼或奧西替尼治療MCF10A細胞，并分析sgRNA文庫以識別新的耐藥變體，評估了與耐藥相關(guān)的EGFR突變。

為了擴大他們的突變篩選，研究人員還使用了啟動編輯來引入更廣泛的EGFR突變，包括來自ClinVar和COSMIC數(shù)據(jù)庫的突變。他們設(shè)計了沒有MLH1基因的MCF10A細胞，以提高引物編輯效率，并通過慢病毒載體傳遞了針對14個已知和重要的EGFR突變的引物編輯指導(dǎo)RNA （pegRNAs）。在pegrna中包含同義突變使研究人員能夠檢查它們對編輯效率的影響。

圖2 堿基編輯掃描屏幕識別MCF10A細胞中的EGFR激活突變

在MCF10A細胞中，這兩種堿基編輯器的編輯效率都達到了95-97%，隨著時間的推移，突變會積累，一些等位基因會出現(xiàn)多次編輯。篩選發(fā)現(xiàn)了基本sgRNAs的缺失，證實了篩選檢測損害細胞活力的突變的能力。值得注意的是，EGFR中影響剪接位點的突變、無義突變和錯義突變與功能喪失效應(yīng)相關(guān)。

篩選顯示已知的和幾種新的EGFR突變與耐藥性有關(guān)，特別是在EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的atp結(jié)合口袋中。對于吉非替尼，已知的突變?nèi)鏣hr790Met，以及先前未表征的結(jié)合袋附近突變，包括Val726、Met766和Thr854，被證實具有耐藥性。對于奧西替尼，Thr790Ala、Gln791Arg和Val845Ala等突變以及c端結(jié)構(gòu)域突變富集，提示不同的耐藥機制。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了EGFR中特定的分子內(nèi)相互作用和結(jié)構(gòu)變化有助于抵抗各種TKIs。

堿基編輯還揭示了影響藥物敏感性的突變的微妙觀點。例如，Val845Ala突變對奧西替尼耐藥，但對吉非替尼敏感，而其他突變，如Lys852Glu，對兩種藥物都有耐藥性。繼發(fā)性突變，如Thr790Met，進一步增強了egfr突變PC-9細胞的耐藥性。引體編輯引入了ClinVar和COSMIC中列出的近92%的EGFR變異，確定了新的突變，包括外顯子20插入和與耐藥性相關(guān)的細胞外結(jié)構(gòu)域突變。

該研究證明了多模態(tài)精確堿基和引物編輯的優(yōu)勢，并為EGFR激活和耐藥性提供了見解。然而，它依賴于egf獨立增殖作為EGFR信號的代理，并且沒有分析受體相互作用或雜合效應(yīng)，因此受到限制。未來的研究可以利用額外的細胞模型和工程細胞系來解決這些問題。

本研究開發(fā)了一個強大的，高分辨率的突變掃描框架，結(jié)合了堿基和起始編輯的能力來分析與耐藥性和腫瘤生長有關(guān)的遺傳變異。將這種方法擴展到更廣泛的遺傳元素和細胞模型，包括原代人類細胞，將有助于闡明各種遺傳變異的臨床相關(guān)性，并支持個性化的癌癥治療。

參考資料

[1] Multimodal scanning of genetic variants with base and prime editing