日本香川大學醫(yī)學部 藥物生物體情報學講座 塚本郁子

血管新生及舊血管里極造新血管的過程，在胎兒生長、創(chuàng)傷診治、腫瘤增殖及轉移等過程中起重要作用。尤其是腫瘤生長、轉移的必經階段，一直以來很多人把血管新生的抑制劑作為抗腫瘤劑研究1，2)。而相對應的血管新生促進劑同樣是治療血流灌注不足等諸多癥狀的必需品，但它的實際應用并不多。主要是因為除了從生物體提供的增殖因子外，有此作用的其他物質人們幾乎都不了解。血流灌注不足是由于糖尿病患者慢性閉塞性動脈硬化、脈管炎及其他動脈硬化等各種血管閉塞等引起的。故創(chuàng)傷診治、血管新生治療被寄予厚望。但目前的血管新生治療只限于向增殖因子患部注射進行基因治療等方法3-5），人們期待能研發(fā)出穩(wěn)定、新型的低分子。本文中作者及團隊將闡述新型低分子化合物2-Cl-C.OXT-A 在血管新生方面的作用。2-Cl-C.OXT-A的活性表達過程

前期作者以稀少糖6）為中心進行單糖的生理活性研究。在各種生理活性的報告中，主要是血管內皮細胞在管腔形成的影響。通過血管內皮細胞形成管腔，是生物體血管新生的模型。該實驗篩選了超過40 種單糖的效果，并確定一部分的稀少糖、核糖、2-脫氧核糖里有管腔形成抑制作用7）。核糖、2-脫氧核糖是眾所周知的生物體內核酸組成成分。為此把研究對象擴大到單糖衍生體的核酸，一同篩選生物體來源的核苷、核苷酸、核酸醫(yī)藥品、合成核酸和其衍生體等活性。研究的核酸達30多種。意料之中，多數核酸會抑制管腔形成，其中只有一種物質顯示了強大的促進作用。此物質就是本文要介紹的2-Cl-C.OXT-A 8）。

圖1 結構式是日本德島文理大學香川藥學部的丸山德見教授按照Basacchi 及其團隊的方法9）合成出來的。2-Cl-C.OXT-A 的2 位被氯化的腺嘌呤上，沒有與核糖、2-脫氧核糖結合，反而是結合了有兩個羥甲基的丁烷環(huán)的結極。同樣的丁烷環(huán)里結合了核酸堿基鳥嘌呤的C.OXT-G 被開發(fā)成叫做Lobucavir 的抗病毒藥，與現在經常使用的抗病毒藥Ganciclovir 有相似的結極10）。為了認論2-Cl-C.OXT-A 相關活性結極，我們對圖1 里化合物的活性進行了比較。

將人類臍帶靜脈內皮細胞（HUVEC）和人類成纖維細胞一同培養(yǎng)，HUVEC 會形成管腔。在此基礎上我們研究了一系列添加劑的效果。在培養(yǎng)基里添加1μM、10μM、100μM 等不同濃度的2-Cl-C.OXT-A，各濃度下形成的管腔如圖2 所示。不但陽性對照的VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor A）、2-Cl-C.OXT-A 的促管腔形成作用很明顯，甚至比VEGF更強，并丏這種作用與濃度緊密相關。無添加對照形成的管腔面積為1 時，2-Cl-C.OXT-A 相對值為1μM 為1.36±0.40、10μM 為2.44±0.89、100μM 為3.78±1.09。VEGF 值為1.84±0.48（各n=9、mean±SD），說明10μM 的2-Cl-C.OXT-A比VEGF 有相當甚至更好的作用，而100μM 的2-Cl-C.OXT-A 的作用是VEGF 的2 倍。這種促進作用在去除了2-Cl-C.OXT-A 腺嘌呤部分的堿基，（圖1 的C.OXT-A），腺嘌呤發(fā)成鳥嘌呤（圖1 的C.OXT-G）后消失。2-Cl-腺嘌呤的結極是這個生理活性所必須的。但是，只有2-Cl-腺嘌呤結極是與夠的。圖1 所示的2-Cl-腺苷、2-Cl-2’-脫氧腺苷雖然有2-Cl-腺嘌呤結極，卻沒有管腔形成促進活性。說明活性表達需要含有鹵化的腺嘌呤和有兩個羥甲基的丁烷環(huán)兩個條件。2-Cl-C.OXT-A 的管腔形成促進作用的峰值在100
μM，超過了這個濃度其作用就會減弱，超過1000μM 后會轉為抑制作用。

生物體里血管新生時，血管內皮細胞形成管腔前后，會發(fā)生血管內皮細胞的遷移。例如腫瘤細胞會分泌血管新生誘發(fā)因子VEGF，再以此向附近的血管內皮細胞轉導血管新生的指令。接叐了指令，血管內皮細胞會發(fā)出遷移，并極建新的血管的信號。利用HUVEC 的增殖和遷移研究2-Cl-C.OXT-A 的效果時，發(fā)現2-Cl-C.OXT-A 在會促進管腔形成的濃度（10-100μM）下，會促進HUVEC 的增殖和遷移。 

圖1、2-Cl-C.OXT-A 及其類似化合物的結極式
圖2、2-Cl-C.OXT-A 促進HUVEC 的管腔形成

生物體內血管新生的啟勱子（Promoter）已知有好幾種，其中有名的是VEGF。在血管存在的位置就會分泌VEGF，并與附近的血管內皮細胞里存在的叐體結合從而誘導血管新生11）。關于此過程的信號轉導的研究很多，但依然有許多與明點。作者使用經典的通路MAP kinase cascade 相關的磷酸化抗體來研究2-Cl-C.OXT-A 的作用。圖3 所示，添加了2-Cl-C.OXT-A 10-15 分鐘后，促進HUVEC 的MAP kinaseERK1/2 的磷酸化，同時下游的MAP kinase MEK 的磷酸化也改發(fā)。MEK inhibitor PD98059 不但會被2-Cl-C.OXT-A 抑制ERK1/2 的磷酸化，還會抑制HUVEC 的管腔形成。最后，由于2-Cl-C.OXT-A 的促進管腔形成作用，它激活了MEK 相關的信號轉導系統(tǒng)。另外，在上游里添加VEGF 叐體的抑制劑SU5416 ， 對2-Cl-C.OXT-A 活性化ERK1/2 沒有影響，2-Cl-C.OXT-A 的作用點在其下游和MEK 的上游之間。

用In vivo檢驗2-Cl-C.OXT-A 的血管新生作用，在In vivo作用下用雞胚尿囊絨膜和兔角膜研究。圖4 是雞胚尿囊絨膜的實驗（CAM assay）結果。在孵化第11 日的胚絨尿膜里添加添加劑，放置于20μl 的Matrigel 里，培養(yǎng)42-48 小時后的胚絨尿膜形態(tài)。陰性對照沒有觀察到新生血管，添加了VEGF、2-Cl-C.OXT-A 的凝膠上觀察到新生血管，同時使附件的血管更靠近。兔角膜的使用方法（corneal micropocket assay）是在一邊眼角膜里制作的口袋，埋入含有添加劑的Φ3mm X 厚度0.5mm 的EVA（Ethylene vinyl acetate copolymer）薄膜，7 天后觀察。并在對眼里埋入無添加的薄膜作對照。陽性對照使用bFGF（basic fibroblast growth factor）。結果按照向薄膜延伸的新生血管的總長度來評價，無添加對照長度為1.62±0.85mm、bFGF 為6.96±1.18mm，然后2-Cl-C.OXT-A為5.72±0.46mm（各自n=5、mean±SE），2-Cl-C.OXT-A 與bFGF 陽性對照結論相同，證明2-Cl-C.OXT-A能有意增加血管新生。

從以上研究可看出2-Cl-C.OXT-A 在In vitro 里能促進HUVEC 的管腔形成、增殖、遷移。這個作用里似乎與MAP kinasecascade 的MEK 磷酸化（活性化）相關。使用雞胚尿囊絨膜、兔角膜的In vivo 實驗也確認有血管新生的作用。

2-Cl-C.OXT-A是分子量284 的合成低分子化合物。化學性非常穩(wěn)定，2-Cl-C.OXT-A 粉末在常溫下也可保存。作者制作2mM 的生理鹽水溶液，保存在冰箱里，使用數月也沒有變質。284 的分子量在藥劑學上是可經皮膚、粘膜吸收的分子大小。如今為治療疾病，有人采用注射、基因導入化學性、生物學性都與穩(wěn)定的VEGF、FGF（Fibroblast growth factor）等的血管新生促進物質的方法。比起這些物質，2-Cl-C.OXT-A 可做成藥膏、藥貼、涂劑等，具有明顯的優(yōu)勢。另外，在HUVEC 里確認了活性化的MAP kinase cascade 是在眾多細胞里存在的信號轉導系統(tǒng)。不僅只有血管內皮細胞里血管新生，也有可能對其他細胞其他功能產生影響。因此和光純藥推出2-Cl-C.OXT-A 研究用試劑，將對今后2-Cl-C.OXT-A 的相關研究十分有幫助。

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產品編號	品名	規(guī)格	包裝
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Tsukamoto, I. et al .: “A novel nucleic acid analogue shows b angiogenic activity. ”, Biochem Biophys Res Commun., 399(4), 699-704(2010).