檢測(cè)mPEG和mPEG化蛋白的ELISA試劑盒

應(yīng)用： 此試劑盒只用于科研，不可用于診斷或治療

產(chǎn)品介紹：
治療蛋白通過(guò)結(jié)合mPEG鏈以PEG化，蛋白PEG化后可通過(guò)減緩蛋白水解和從循環(huán)系統(tǒng)中清除的速率來(lái)延長(zhǎng)半衰期，因此可以增加其療效（refs.1&2）。mPEG化蛋白的藥效學(xué)通常情況下應(yīng)用對(duì)多肽鏈的特異性分析進(jìn)行評(píng)估。但這些方法需要消耗大量時(shí)間，且建立目標(biāo)蛋白的ELISA昂貴。mPEG ELISA試劑盒可以檢測(cè)mPEG鏈，因此適合評(píng)估m(xù)PEG化生物制劑和mPEGs的藥效學(xué)。

分析試劑盒基于夾心ELISA原理，它應(yīng)用了兩個(gè)抗-PEG小鼠單克隆抗體。針對(duì)PEG的聚乙二醇主鏈的特異性抗體包被在96孔板上，用于捕獲。另一專(zhuān)一性抗體用于特異性結(jié)合結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶的mPEG的末端甲氧基，進(jìn)行檢測(cè)。

此ELISA試劑盒可用于檢測(cè)游離mPEG（圖1）和帶有一個(gè)或多個(gè)mPEG鏈的mPEG化蛋白（圖2）。然而，它不能檢測(cè)缺少末端甲氧基的PEG鏈。試劑盒的靈敏度隨著mPEG鏈的長(zhǎng)度而變化，因此mPEG或mPEG化的分子應(yīng)該產(chǎn)生一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究表明此試劑盒可識(shí)別分子量大于等于2kDa的mPEG。試劑盒提供5kDa mPEG-氨的標(biāo)準(zhǔn)品，可方便用戶(hù)去檢測(cè)試劑盒的性能。

分析方法：
首先將100ul的HRP抗-mPEG加入到微孔板中，然后加入100ul的稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，在微孔板振蕩器上混勻1小時(shí)。沖洗微孔以后，加入100ul的TMB到微孔中，孵育20分鐘，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色。加入1N HCL 100ul終止反應(yīng)，藍(lán)色會(huì)變?yōu)辄S色，檢測(cè)其在450nm處的吸光值。mPEG的濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得。

試劑盒包含以下內(nèi)容：
抗-PEG包被的96孔板（12個(gè)可拆開(kāi)的條，每條8孔），在-20℃下儲(chǔ)存
HRP 抗-mPEG復(fù)合物，25ul（1瓶）。在-20℃下儲(chǔ)存
mPEG稀釋液，50ml
5kDa mPEG-氨標(biāo)準(zhǔn)品，100ul（1瓶）。在-20℃下儲(chǔ)存           
mPEG清洗緩沖液，60ml
TMB試劑，11ml
終止液，11ml

需提供以下試劑或耗材：
移液器和槍頭
蒸餾水或去離子水
聚丙烯或玻璃管
漩渦混合器
微孔板振蕩儀（混合速度，150轉(zhuǎn)/分鐘）
平板墊圈
在450nm處光密度在0-4的平板閱讀器
繪圖軟件

標(biāo)準(zhǔn)液的制備：

 1、標(biāo)記8支聚丙烯管或玻璃管，濃度為20,10,5,2.5,1.25,0.625，0.3125和0ng/ml

 2、制備20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)記在5kDa mPEG標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上

 3、加入250ul的稀釋液到管中，標(biāo)記為10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125和0ng/ml

 4、吸取250ul的20ng/ml mPEG標(biāo)準(zhǔn)品到管子中，標(biāo)記10ng/ml，并混合。此試劑盒提供10ng/ml PEG-BSA標(biāo)準(zhǔn)品。

 5、通過(guò)連續(xù)稀釋相同地制備5,2.5,1.25,0.625和0.3125ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品

分析過(guò)程：

 1、保護(hù)支持板上合適數(shù)量的包被孔

 2、加入100ul的HRP 抗-mPEG復(fù)合物到孔中

 3、吸取100ul標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到孔中（建議標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別一式三份）

 4、在150轉(zhuǎn)每分鐘的微孔板振蕩器上室溫（25℃）孵育1小時(shí)

 5、使用一個(gè)平板墊圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液

 6、吸取100ul的TMB試劑到每個(gè)孔中

 7、在150轉(zhuǎn)/分鐘的微孔板振蕩器上輕輕地混合20分鐘

 8、加入100ul的終止液到每個(gè)孔中終止反應(yīng)

 9、輕輕混合直到藍(lán)色變?yōu)辄S色

 10、5分鐘內(nèi)讀取450nm處的吸收值

結(jié)果計(jì)算：

 1、讀取參考標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在450nm處的平均吸光值

 2、用平均吸光值和濃度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y軸是吸光值，X軸是濃度

 3、用合適的模型和電腦繪圖軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)

 4、使用每個(gè)樣品的平均吸光值來(lái)確定mPEG或mPEG化蛋白的濃度值

 5、濃度乘以稀釋因子計(jì)算出血清或血漿樣品中mPEG化蛋白的實(shí)際濃度

 6、如果樣品的吸光度值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，樣品需要重新稀釋和檢測(cè)

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